[发明专利]SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用有效

专利信息
申请号: 202010770180.7 申请日: 2020-08-03
公开(公告)号: CN111848772B 公开(公告)日: 2022-03-18
发明(设计)人: 唐娜;沈志强;张倩;苑文娴;管宇;肖跃强;苗立中 申请(专利权)人: 山东绿都生物科技有限公司;山东省滨州畜牧兽医研究院
主分类号: C07K14/47 分类号: C07K14/47;C12N15/12;C12N5/10;C12N15/90;A61K39/275;A61P31/20;C12R1/91
代理公司: 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 代理人: 王艳
地址: 256600 *** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: samd9 突变型 蛋白 vero 细胞系 及其 构建 方法 应用
【说明书】:

发明公开了SAMD9突变型蛋白,所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺少第61~448位氨基酸。本发明还公开了编码该蛋白的基因、细胞系及其在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。本发明还公开了SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法。本发明通过基因编辑技术敲除了Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域及其两侧序列,以降低Vero细胞的病毒抑制功能,获得的SAMD9突变型蛋白Vero细胞对山羊痘病毒具有更高的易感性,且遗传性状稳定,能够应用到山羊痘病毒等病毒疫苗生产中,替代原代细胞疫苗生产工艺,大幅度降低生产成本,并提高疫苗的安全性。

技术领域

本发明属于生物制品领域,涉及细胞与病毒疫苗领域,具体涉及SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织允许用于疫苗生产的细胞株,它的研究背景相对清晰,又对多种病毒敏感,在病毒的分离培养、机制研究等方面也具有非常重要的应用价值。在痘病毒研究方面,早从上世纪70年代起就陆续有报道猴痘病毒(Lourie,Binghamet al.1972)、痘苗病毒(Tsuchiya and Tagaya 1979)、小鼠痘病毒(Tantawi,Zaghloul etal.1983)、骆驼痘病毒(el Harrak,Loutfi et al.1991)等正痘病毒属病毒,羊口疮等副痘病毒属病毒(Rziha,Henkel et al.2000)均可在Vero细胞生长形成病变灶。

但是,常用的Vero细胞在羊痘病毒属痘病毒(山羊痘病毒、绵羊痘病毒、皮肤结节病病毒)培养方面的应用却表现出很大的局限性。山羊痘病毒和绵羊痘病毒对原代羔羊睾丸细胞和肾细胞最易感(OIE陆生动物手册,2017),直接在Vero细胞上接种往往不能出现稳定的病变。现有的山羊痘病毒和绵羊痘病毒Vero细胞适应株是先将羊痘病毒在原代羊细胞中连续传代几十代,再转接种至Vero细胞上连续传代9~26代以上而成的(Hosamani,Nandiet al.2004),(Chaudhary,Pandey et al.2009)。即便如此,仍然有很多羊痘病毒株在Vero细胞上不能稳定产生病变(6代以后病变消失,安维雪等,2016)或者增殖效价相对较低(比原代羊睾丸细胞培养低31.6~63.1倍,李春艳,2011),导致我国现有的羊痘疫苗生产工艺仍然摆脱不了原代羊睾丸细胞生产方法(中华人民共和国兽药典三部2015版)。然而,原代细胞制备需要大量新鲜羔羊组织,羔羊组织的无菌摘取操作要求复杂、组织中细胞数量有限、羔羊成本较高,严重限制了山羊痘疫苗的批生产产量。目前国内绵羊养殖水平不一,羔绵羊感染布氏杆菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒等致病菌及病毒的风险仍然较高,也在很大程度上增加了操作人员生物安全风险和生产检验成本。因此,如能显著提高Vero细胞增殖羊痘病毒的能力,替代现有原代细胞培养方法,必将有力提升羊痘疫苗生产技术,促进羊病防控领域的技术进步。

随着功能基因组学的发展,蛋白质相互作用的研究已成为分子生物学家研究的热点之一,蛋白质与其他蛋白质之间形成的稳定或临时复合物,对生物体的活动如信号引导、转录、代谢网络调控等有很多影响。目前对羊痘病毒在宿主细胞中增殖的机制仍然较为缺乏,但是Vero细胞中有一种广泛存在于多种动植物细胞质中的蛋白——SAMD9蛋白,可能与应激、抗病毒和细胞凋亡有关。RNA干扰试验证明,SAMD9是细胞固有免疫的关键蛋白,其表达量下降能够明显提高细胞内日本乙型脑炎病毒(JEV)的复制(Zhang LK,2013)。痘苗病毒感染Vero细胞后,细胞中的SAMD9蛋白可以与痘苗病毒的C7L家族蛋白结合,形成“分子爪”状结构,抑制核糖体中cap依赖性蛋白质的合成和抑制病毒mRNA的解离,阻断病毒mRNA翻译过程(Meng X,2015)。

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