[发明专利]构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用

权利要求书

1.一种构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，其特征在于，所述方法通过CRISPR-Cas9双质粒基因编辑技术无痕敲除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因得到重组菌，使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外；所述食烷菌为Alcanivorax borkumensis，保藏号为DSM11573；双质粒系统包括：工具质粒pCas9，addgene编号#62225，和辅助质粒pTargetF，addgene编号#62225。

2.根据权利要求1所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

⑴构建重组辅助质粒：替换辅助质粒pTargetF中的向导RNA(gRNA)片段，插入供体分子(Donor)的核苷酸序列，得到重组辅助质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述gRNA的核苷酸序列包括具有特异性的待敲除基因中的一段20bp的片段和gRNA骨架(gRNA scaffold)共同组成识别切割位点的片段，所述片段如序列表中序列4所示；所述供体核苷酸序列为基于食烷菌基因组中酰基辅酶A硫酯酶基因的上游序列和下游序列合成的序列，所述上游序列和所述下游序列如序列表中序列2和序列3所示；

⑵将所述重组辅助质粒和工具质粒导入出发菌株，实现基因敲除，得到包含质粒的敲除株；所述食烷菌为出发菌株；

⑶包含双质粒的敲除株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下消除工具质粒，在37℃培养下消除重组辅助质粒，即得到所述敲除株。

3.一种基于CRISPR-Cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

⑴制备质粒：

(1.1)替换gRNA的特异性片段：以酰基辅酶A硫酯酶基因(tesB)序列为模板，设计特异性识别所述基因的gRNA；根据原质粒序列和特异性gRNA片段设计一对引物，利用反向聚合酶链式反应(反向PCR)，用特异性gRNA片段替换pTargetF上的原gRNA片段，所得到的线性化质粒为pTargetF-gRNA；

(1.2)合成供体分子：以tesB基因的上游序列和下游序列为模板，各设计一对引物；

上游序列的正向引物含EcoRI酶切位点，下游序列的反向引物含HindIII的酶切位点，进行重叠聚合酶链式反应(重叠PCR)反应，回收得到带有酶切位点的供体分子，供体分子序列如序列表中序列5所示；

(1.3)连接质粒骨架和同源臂：使用EcoRI、HindIII限制性内切酶分别双酶切质粒pTargetF-gRNA和DNA片段Donor，回收线性化产物；回收线性化产物，在T4连接酶作用下进行连接，回收得到质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述质粒序列如序列表中序列6所示；

⑵制备敲除株：

(2.1)质粒导入食烷菌：将质粒pTargetF-gRNA-Donor和质粒pCas分别以电转化形式转入食烷菌，在卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的ONR7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pCas和pTargetF-gRNA-Donor所构成双质粒系统的食烷菌菌株；所述ONR7a培养基为德国微生物菌种保藏中心DSZM950培养基；

(2.2)消除质粒：所述双阳性克隆转接至含卡那霉素(50mg/L)和IPTG(0.5mM)的ONR7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒pTargetF-gRNA-Donor；涂布培养液于含卡那霉素(50mg/L)的ONR7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pCas的重组菌；

所述单阳性克隆转接于ONR7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pCas；涂布培养液于ONR7a平板，得到无质粒的重组菌；

⑶验证重组菌：以重组菌作为模板进行PCR，使用上述(1.2)中的tesB基因的上游序列的正向引物和tesB基因的下游序列的反向引物，在适宜体系和程序下进行PCR反应，回收PCR产物进行测序，测序结果与供体序列一致，证明同源重组正确，获得食烷菌tesB基因的敲除株。