[发明专利]构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用在审

专利信息
申请号: 202010770287.1 申请日: 2020-08-04
公开(公告)号: CN111909952A 公开(公告)日: 2020-11-10
发明(设计)人: 郑维爽;黄艺;于盛洋 申请(专利权)人: 北京大学深圳研究院
主分类号: C12N15/74 分类号: C12N15/74;C12N15/90;C12P7/62;C12R1/01
代理公司: 深圳市惠邦知识产权代理事务所 44271 代理人: 满群
地址: 518057 广东省深圳市南山*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 构建 食烷菌敲 基辅 硫脂酶 基因 方法 应用
【说明书】:

发明涉及构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用。敲除基因为酰基辅酶A硫脂酶,其上下游的核苷酸序列如序列表中序列所示;出发菌株食烷菌(Alcanivorax borkumensis),保藏号为DSM11573。所述方法通过CRISPR‑Cas9双质粒基因编辑技术无痕敲除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因得到重组菌,使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外;双质粒系统包括:工具质粒pCas9,addgene编号#62225,和辅助质粒pTargetF,addgene编号#62226。

技术领域

本发明基因工程技术领域,特别涉及一种构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是唯一的一种由微生物生产、可被微生物降解的热塑性塑料材料,作为石油基塑料的替代品,可缓解日益严重的塑料污染问题。目前,PHA通过细胞内累积的方式发酵生产。PHA作为细菌的胞内储能物质,累积量无法超过细胞干重,使生产速度直接受细菌生命周期长度影响。具有持续胞外分泌PHA能力的菌株,能有效提高细菌单位时间生产PHA的效率。

食烷菌具有完整的油类代谢途径,能够合成脂肪酸、甘油三酯和蜡酯并分泌到细胞外。虽然食烷菌也能合成PHA,但是由于3-羟基脂肪酸((3-HA)和PHA的合成途径使用相同的前体,两者是竞争途径的关系,所以通常食烷菌内并没有累积PHA。

通过转座子随机突变,在食烷菌的酰基辅酶A硫脂酶(tesB)基因插入一段序列,会使食烷菌失去3-HA合成能力,从而激活PHA的合成途径,并实现PHA胞外分泌。但是,转座子突变属于有痕突变,这种突变方法在原有基因中插入大片段序列,虽然使得基因失活,但是可能对下游基因表达产生未知影响。而且,转座子突变的随机性决定这种方法一方面无法进行定点突变,另一方面耗时耗力。因此,这种方法无法用于食烷菌在基因水平上的进一步优化。

发明内容

本发明所解决的技术问题是针对现有技术中的食烷菌缺少稳定的定点基因敲除方法,而提供一种基于CRISPR-Cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法。使用该方法通过敲除酰基辅酶A硫脂酶(tesB)基因得到重组菌,使食烷菌所产PHA分泌到细胞外,使食烷菌在生命周期内累积的PHA超过细胞总重量,从而提高PHA生产效率的食烷菌酰基辅酶A硫酯酶基因敲除株利用十八烷烃或丙酮胞外制备PHA的方法。

本发明的技术解决方案是所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法,其特殊之处在于,所述方法通过CRISPR-Cas9双质粒基因编辑技术,无痕敲除除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因,得到重组菌,使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外;所述tesB基因的核苷酸序列,其上游和下游核苷酸序列如序列表序列1、序列2和序列3所示;所述食烷菌为Alcanivorax borkumensis,保藏号为DSM11573;双质粒系统包括:工具质粒pCas9,addgene编号#62225,和辅助质粒pTargetF,addgene编号#62225。

作为优选:所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法,其特殊之处在于,包括如下步骤:

⑴构建重组辅助质粒:替换辅助质粒pTargetF中的向导RNA(gRNA)片段,插入供体分子(Donor)的核苷酸序列,得到重组辅助质粒pTargetF-gRNA-Donor;所述gRNA的核苷酸序列包括具有特异性的待敲除基因中的一段20bp的片段和gRNA骨架(gRNA scaffold)共同组成识别切割位点的片段,所述片段如序列表中序列4所示;所述供体核苷酸序列为基于食烷菌基因组中酰基辅酶A硫酯酶基因的上游序列和下游序列合成的序列,所述上游序列和所述下游序列如序列表中序列2和序列3所示;

⑵将所述重组辅助质粒和工具质粒导入出发菌株,实现基因敲除,得到包含质粒的敲除株;所述食烷菌为出发菌株;

⑶包含双质粒的敲除株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下消除工具质粒,在37℃培养下消除重组辅助质粒,即得到所述敲除株。

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