[发明专利]低拷贝质粒菌种的质粒发酵方法

权利要求书

1.一种低拷贝质粒菌种的质粒发酵方法，其特征在于，包括：

发酵罐参数控制：完成发酵罐的灭菌、安装及校准后，将溶解氧与转速关联控制，通过调节转速来维持溶解氧在20％以上，转速调节范围为200rpm～1200rpm；温度37.0±2℃，通气量3.0±2L/min；pH7.0±1.0；

发酵培养：将菌液接种至发酵罐，于发酵培养基中开始培养；培养至3±1h时开始第一次补料，补料LBG与补料铵的补料速度均为0.2±0.08ml/3L/min；继续培养至8±1h时开始第二次补料，补料LBG的补料速度增加至0.4±0.08ml/3L/min，补料铵的补料速度保持0.2±0.08ml/3L/min；继续培养至11±1h时开始第三次补料，补料LBG的补料速度增加至0.6±0.08ml/3L/min，补料铵的补料速度增加至0.4±0.08ml/3L/min；培养过程中若转速达到1200rpm仍不足以维持溶解氧在20％以上，则启动补氧；继续培养至13±1h时停止发酵；

所述发酵培养基的配方为：以质量体积浓度计，大豆蛋白胨0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.8％，硫酸铵0.2～0.6％，七水合磷酸氢二钠0.5～1.0％，磷酸二氢钾0.05～0.25％，丙三醇1.0～2.0％，硫酸镁0.01～0.10％，消泡剂0.02～0.08％；

所述补料LBG的配方为：以质量体积浓度计，大豆蛋白胨5～15％，酵母粉1～10％，甘油10.0～20.0％；

所述补料铵为：以质量体积浓度计10～30％的硫酸铵。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低拷贝质粒的质粒拷贝数＜20。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种选自大肠杆菌(E.coli)；优选的，所述菌种为大肠杆菌JM109、DH5α、Stbl3、Top10或DH10B。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐参数控制中，温度为37.0±1℃，通气量为3.0±1L/min；优选的，发酵罐参数控制中，温度为37.0±0.5℃，通气量为3.0±0.5L/min；更优选的，发酵罐参数控制中，温度为37.0℃，通气量为3.0L/min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐参数控制中，设置溶氧量控制值＝30％，并将溶氧量与转速关联控制，在培养过程中通过转速来维持溶解氧始终不低于20％；若转速达到1200rpm而溶解氧仍下降至20％及以下，则启动补氧。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中，第一次补料在培养至3±0.5h时开始；优选的，第一次补料在培养至3±0.25h时开始；更优选的，第一次补料在培养至3±0.1h时开始。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中，第一次补料时，补料LBG与补料铵的补料速度均为0.2±0.05ml/3L/min；优选的，第一次补料时，补料LBG与补料铵的补料速度均为0.2±0.03ml/3L/min；更优选的，第一次补料时，补料LBG与补料铵的补料速度均为0.2±0.01ml/3L/min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中，第二次补料在培养至8±0.5h时开始；优选的，第二次补料在培养至8±0.25h时开始；更优选的，第二次补料在培养至8±0.1h时开始。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中，第二次补料时，补料LBG的补料速度为0.4±0.05ml/3L/min，补料铵的补料速度为0.2±0.05ml/3L/min；优选的，第二次补料时，补料LBG的补料速度为0.4±0.03ml/3L/min，补料铵的补料速度为0.2±0.03ml/3L/min；更优选的，第二次补料时，补料LBG的补料速度为0.4±0.01ml/3L/min，补料铵的补料速度为0.2±0.01ml/3L/min。