[发明专利]低拷贝质粒菌种的质粒发酵方法

说明书

本发明提供一种低拷贝质粒菌种的质粒发酵方法，其特征在于，发酵罐参数控制：完成发酵罐的灭菌、安装及校准后，将溶氧量与转速关联控制，通过调节转速来维持溶解氧在20％以上，转速调节范围为200rpm～1200rpm；发酵培养：将菌液接种至发酵罐，于发酵培养基中开始培养；培养至约3h时开始第一次补料，继续培养至约8h时开始第二次补料，再继续培养至约11h开始第三次补料，培养过程中若转速达到1200rpm仍不足以维持溶解氧在20％以上，则启动补氧；继续培养至约13h时停止。本发明提供了一种可产业化的发酵方法，创造性的采用双补料培养基和对数期梯度补料方法，优化了补料速度和培养时间，与优化前相比能将低拷贝质粒菌种的质粒发酵产量显著提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种可用于基因治疗等用途的低拷贝质粒菌种的发酵方法。

背景技术

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗已成为很多重大疾病的有效治疗方法，在血友病、镰状细胞病、失明、多种严重的遗传性神经退行性疾病以及骨髓和淋巴结多发癌等疾病的治疗中均取得了重大进展(Gene therapy comes of age,2018,Science)。目前欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)已经批准6种基因治疗产品：2种用于B细胞癌的嵌合抗原受体T细胞产品(Car-T)和4种用于严重单基因疾病，如β-地中海贫血、一种罕见的视力丧失、脊髓性肌萎缩和罕见的原发性免疫缺陷(Gene therapy,2019,The New EnglandJournal of Medicine)。

基因治疗主要采用病毒和非病毒两种载体形式。从长远看，非病毒载体具有低免疫原型、低成本、易规模化等优点，因而具有更好的临床应用前景。而当前大部分细胞和基因治疗项目所采用的载体都为病毒载体。目前最为常用的病毒载体包括腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)、慢病毒(Lentivirus，LV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)和逆转录病毒(Retrovirus，RV)等。这些病毒载体均可以通过包装质粒进行生产，因此，无论是从眼前看，还是从长远看，质粒DNA都是基因治疗的基础，而且需求量非常大。

众所周知，通过细菌发酵及碱裂解法(A rapid alkaline extraction procedurefor screening recombinant plasmid DNA,1979,Nucleic Acids Res)可获得质粒。但目前的专利中(CN 1914330 B，2012；CN 101213294 B，2013；CN 103396975 B，2016；CN108148831 A，2018；CN 109337834 A，2019)均为中高拷贝质粒的发酵生产，未涉及低拷贝质粒的生产。

低拷贝质粒菌种通常指菌种的质粒拷贝数为5-10(美国专利US5614382A，1995)。专利CN201610864971(2016)中描述了一种低拷贝pET质粒，从摇瓶培养的300ml菌液中获得100μg pET质粒，质粒产量折算为1mg/L。由于目前针对低拷贝质粒生产的相关报道非常少，此处根据通常经验的发酵产量为摇瓶产量的10倍估算，该低拷贝数质粒的发酵产量估算为10mg/L。

在文献(Enhancing yields of low and single copy number plasmid DNAsfrom E.coli cells,2017,J Microbiol Methods.)中，报道了一种单拷贝质粒pBeloBAC11的质粒产量，1.5ml菌液中获得200ng质粒，折算质粒产量为0.13mg/L，而低拷贝质粒可获得5000ng质粒，折算质粒产量为3.3mg/L。

针对低拷贝质粒的发酵生产产量低的问题，本发明拟提供了一种产量显著提高的针对低拷贝质粒的发酵方法。

发明内容