[发明专利]一种人胚胎干细胞诱导分化成间充质干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种人胚胎干细胞(hESC)诱导分化成间充质干细胞(MSCs)的方法，主要涉及三个阶段，包括原条(PS)细胞的诱导，向外侧中胚层细胞的分化以及MSCs的分化。所述方法采用了分阶段分化的方法，整个分化过程可以追踪并质控，成本较低，且操作简单；获得hESCs诱导分化成MSCs的中间产物，包括PS细胞、外侧中胚层细胞和MSCs；可以高效产生数量更多的MSCs，倍增时间更短，并且可重复，最短仅需17天即可获得成熟的MSCs；其中前两个阶段的分化诱导培养基为成分明确的无血清培养基，使分化出来的MSCs免受外源物质的污染，保证了其均一性和临床适用性。

技术领域

本发明涉及生物与医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种人胚胎干细胞(hESC)诱导分化成间充质干细胞(MSCs)的方法。

背景技术

间充质干细胞由(MSCs)于其独特的生物学特性，多种功能和潜在的治疗价值而吸引了广泛的关注。由于其具有再生能力和免疫调节特性(Le et al.，2012)，MSCs已被用于治疗各种退行性和炎症性疾病(Shi et al.，2018)，如关节软骨损伤、移植物抗宿主病和心肌缺血等。几乎在所有结缔组织中都发现了MSC，例如脐带和血液，羊膜和体液，胎盘，骨髓，脂肪和牙髓。MSCs具有高增殖能力和可塑性，可以分化为许多体细胞谱系，并且可以迁移并归巢到受伤的组织中(Sohni et al.，2013)。然而，体细胞来源的MSCs受细胞数量、异质性和生物安全问题的限制，使得其临床治疗应用潜力受到一定的限制，并且如果可能的话，可能会传播供体的病原体(Parekkadan et al.，2010)。

近年来，许多文章已经报道开发出许多方案，可以将人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化产生MSCs，为其用于临床治疗提供可能性。

人胚胎干细胞来源的间充质干细胞(hESC-MSCs)具有与成体人MSCs相似的生物学特性和功能。相对于成体来源的MSCs来说，hESC-MSCs具有以下优点：(1)来源无限并且一致，不受细胞数量的限制；(2)具有更高的纯度和更快的增殖速度；(3)具有较低的免疫排斥，无肿瘤发生；(4)可以诱导产生大量的病人特异的MSC，像药品一样，可以事先备好，随取随用，易质控。

现有的从ESC产生MSCs的方法主要有：OP9共培养法(Barberi et al.，2005，Olivier et al.，2006)，三维胚状体(EB)诱导法(Brown et al.，2009，Wei et al.，2012)和培养基直接诱导法(Gonzalo-Gil et al.，2016，Harkness et al.，2011)。尽管取得了一定的进展，但现有分化方案仍然存在局限性。例如，大多数策略都需要费力的操作，包括刮取，手工挑选，细胞分选或连续传代(Fukuta et al.，2014；Gibson et al.，2017；Kopheret al.，2010)。此外，目前的分化方法使用未明确的成分(例如胎牛血清或OP9饲养细胞)会极大地损害其一致性和临床适用性(Barberi et al.,2005,Hwang et al.,2008,Olivieret al.,2006)，并且耗时且通常需要数周才能获得均匀一致的MSCs(Boyd et al.，2009；Wang et al.，2016)。

CN104487568B公开了一种利用胚胎干细胞经过中间产物滋养细胞分化而发育，并且培养所述分化的滋养细胞进而向hESC-T-MSCs或T-MSCs分化。该方法采用的hESC需在已被辐射的小鼠胚胎成纤维细胞做饲养细胞的条件下培养(见实施例1)，对后期的细胞移植存在潜在的危险性；同时由于该方法无法对从滋养层细胞分化到MSCs过程中的中间产物阶段Pre-T-MSC进行质控，因此导致分化过程难以一致化控制，难以得到整齐一致的MSCs。

CN108753711A公开了一种在多能干细胞培养体系的基础上，通过低糖培养基对hPSC连续进行处理，随后用明胶包被培养系统对细胞进行压力筛选，并通过胰蛋白酶对细胞连续单细胞传代，从而将hPSC分化为hMSCs。该培养方法耗时长，需1个月，并且还需明胶包被培养系统对细胞进行压力筛选，操作较费力。