[发明专利]一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法

权利要求书

1.一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：以豌豆乳清为原料，使用天然可食性的负电荷多糖作为回收材料，进行复配；利用负电荷多糖优先结合非目标蛋白沉淀，并与目标蛋白发生相分离的原理，通过调节复凝聚条件，沉淀豌豆乳清中的非目标蛋白，实现目标蛋白的分离纯化，得到豌豆清蛋白PA1a；具体步骤如下：

（1）豌豆乳清液的预处理：用盐酸将豌豆乳清液调节pH至4.0-5.0，在4-10℃下静置24-48h；离心除沉淀，加入碱液调节上清液pH至7.0-8.0，得到预处理的豌豆乳清液，测定蛋白质含量；

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：取固体多糖样品粉末，配制质量浓度为0.1%-0.6%的多糖溶液；按照蛋白质:多糖质量比10-5:1向步骤（1）制备的豌豆乳清液中添加相应体积的多糖溶液，并用盐酸调节pH至3.5-4.6，室温搅拌15-30 min，4000-6000rpm离心10-20 min，沉淀即为多糖-PA2/植物凝集素的复凝聚沉淀物，收集上清液，即得富集PA1a的粗提纯蛋白液；

（3）纯化PA1a清蛋白：将步骤（2）得到的富集PA1a的粗提纯蛋白液，调节pH至7.0-8.0，用截留分子量为10-100 kDa的超滤设备进行超滤除去多糖，3500-5000 rpm离心15-30min，重复超滤1-2次，收集透过液，再用截留分子量为1000-3500Da的超滤设备进行超滤浓缩，除去小分子物质，收集截留液，即得纯化的PA1a蛋白液；

（4）PA1a蛋白冷冻干燥：将步骤（3）所得PA1a蛋白液，于-30℃冷冻24-48 h，冷冻样品置于-40~-60℃、5~10 Pa下进行真空冷冻干燥48-72 h，即制备得到PA1a豌豆清蛋白。

2.根据权利要求1所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步骤（1）所述的豌豆乳清液来源于豌豆分离蛋白加工的副产物及豌豆粉丝废水经沉淀豌豆分离蛋白后的上清液，其蛋白质含量为0.1%-0.6%。

3.根据权利要求1所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步骤（1）中的离心条件为：4000-8000 rpm，15-30min。

4.根据权利要求1所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步骤（2）所述的负电荷多糖具体为硫酸基团多糖和羧基多糖；其相对分子量范围大于100 kDa。

5.根据权利要求4所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：所述硫酸基团多糖为硫酸葡聚糖，卡拉胶κ-，ι-，λ，硫酸软骨素或岩藻多糖；所述羧基多糖为羧甲基纤维素，海藻酸钠，黄原胶或果胶。

6.根据权利要求1所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步骤（2）所述的负电荷多糖的质量浓度与所使用的豌豆乳清液中蛋白质量浓度保持一致。

7.根据权利要求1所述利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步骤（3）所述的用截留分子量为10-100 kDa的超滤设备进行超滤除去多糖，优先选择截留分子量高的超滤膜；用截留分子量为1000-3500 Da的超滤设备进行超滤浓缩，除去小分子物质，优先选择截留分子量低的超滤膜。