[发明专利]一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法

说明书

一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，属于蛋白质提取技术领域。本发明使用了天然可食性的负电荷多糖作为回收材料，利用负电荷多糖可以优先结合非目标蛋白沉淀，并与目标蛋白发生相分离的技术原理，实现豌豆清蛋白PA1a的分离纯化，制备单一的PA1a。从资源回收利用的角度来看，本发明可以实现高附加值利用豌豆分离蛋白副产物，并从中制备高纯度的高含硫活性蛋白组分，为后续的研究提供技术支持。本发明可以提高豌豆乳清的综合利用，PA1a蛋白回收率高，纯度高，且本发明对设备要求低，操作简单快速，无环境污染问题。

技术领域

本发明涉及一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，属于蛋白质提取技术领域。

背景技术

近年来，植物蛋白引起越来越多人的兴趣，人们的饮食结构也逐渐向可持续的植物成分转变。其中，豌豆作为可持续作物，不仅是淀粉产品的良好来源，更是蛋白产品的良好来源。豌豆蛋白作为低致敏性蛋白，没有转基因风险且具有较高的营养价值。在欧美国家，豌豆蛋白乳饮料和发酵乳等备受关注，越来越成为牛乳蛋白饮品的重要替代品。在我国，豌豆蛋白不仅利用率低，且对豌豆蛋白的利用多集中在豌豆分离蛋白，造成占豌豆蛋白含量20%-30%的豌豆乳清蛋白浪费。 豌豆乳清蛋白中硫含量高，硫含量可占总豌豆含硫蛋白的三分之二以上，豌豆乳清蛋白的浪费不仅使得含硫蛋白的大量损失，且大量排放也致使环境问题。

豌豆乳清中富含多种2S和7S乳清蛋白组分，主要包括PA2，PA1和植物凝集素，均具有不同的生理活性。PA1是主要的豌豆2S乳清蛋白之一，其含硫氨基酸约占种子中总含硫量的50%，是由PA1a和PA1b组成，其中 PA1a分子量约6 kDa。PA1已经被证实是对多种昆虫具有毒害作用的昆虫毒素生物活性肽。目前对PA1a的纯化是以John. A. GATEHOUSE提供的方式为主，采用Sephadex G-75和DEAE-纤维素色谱柱洗脱得到。传统的色谱柱分离虽具有较高的选择性，但其昂贵的价格和低的分离速度使得PA1a的分离纯化具有较高的成本。而多糖/蛋白静电作用驱动的复凝聚法制备不仅能快速、高效，而且能以低成本大量得到纯化的PA1a。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，该方法快速高效，成本低廉。

本发明的技术方案，本发明提供的一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，以豌豆蛋白及粉丝废水加工副产物豌豆乳清为原料，选取一定浓度的不同类型的负电荷多糖溶液作为回收材料，按照一定的物质量比例加入到豌豆乳清中进行选择性复凝聚；利用负电荷多糖优先结合非目标蛋白沉淀，并与目标蛋白发生相分离的原理，通过控制多糖用量和溶液pH，沉淀去除豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素，获得含有PA1a的上清液；通过调节pH，超滤离心除残留多糖及除小分子物质，制备得到单一的PA1a蛋白组分，再经冷冻干燥得到纯度较高的单一豌豆清蛋白PA1a产品。

本发明流程图如图1所示，具体步骤如下：

（1）豌豆乳清液的预处理：用盐酸将豌豆乳清液调节pH至4.0-5.0，在4-10℃下静置24-48h，离心除沉淀，加入碱液调节上清液pH至7.0-8.0，得到预处理的豌豆乳清液，测定蛋白质含量。

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：取固体多糖样品粉末，配制质量浓度为0.1%-0.6%的多糖溶液；按照蛋白质:多糖质量比10-5:1向步骤（1）制备的豌豆乳清液中添加相应体积的多糖溶液，并用盐酸调节pH至3.5-4.6，室温搅拌15-30min，4000-6000 rpm离心10-20 min，去除沉淀，沉淀即为多糖-PA2/植物凝集素的复凝聚沉淀物。收集剩余上清液，即得富集PA1a的粗提纯蛋白液。