[发明专利]SVF细胞以及制备方法与应用

说明书

本发明公开了SVF细胞以及制备方法与应用，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。本发明采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性大、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究，比如关节炎药物的制备研究、软骨损伤药物的制备研究、美容药物的制备研究等。

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及SVF细胞以及制备方法与应用。

背景技术

作为能够完全为人体所接受并能够大量获得的组织填充材料，自体脂肪组织是理论上最理想的的软组织填充材料来源。然而脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性限制了其临床应用。2007年Yoshimura等报导了将基质血管成分细胞辅助脂肪移植应用于隆胸手术,取得了良好的效果。间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中,它是一种具有多向分化潜能的细胞,具有促进组织再生的潜能。MSCs能通过促进局部组织的血管形成及组织再生从而加速创面的愈合。但是由于骨髓中的MSCs含量较低而且提取困难而限制了骨髓来源的MSCs在临床中的应用。研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs,而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点，传统的化学消化法所分离获得基质血管片段(SVF)为细胞悬液,并非黏附在细胞外基质(ECM)上的生理状态,所以移植后ASCs易被宿主巨噬细胞吞噬,使成熟脂肪细胞和ASCs均不能长久成活,这是导致脂肪移植保留率不稳定的主要原因，现有技术通过对Nanofat进一步的处理,提取一种富集SVF细胞和ECM的高浓度产物,以提高脂肪移植的成活率和稳定性,特命名为脂肪来源干细胞基质胶ECM/SVF-gel。2001年Zuk首次发现SVF包含多种细胞成分,包括MSCs、内皮前体细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等成分,而且可以诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等。还有研究认为SVF可以通过分化成血管内皮细胞、分泌促血管形成及抗凋亡的生长因子等多方面来促进难愈性创面的愈合。现有研究将SVF应用于各种病因所致的难愈性创面上,对其愈合结果进行综合性临床研究,从而对SVF的应用疗效做更全面的评估。这可以给今后SVF的应用提供更有价值的依据,从而解决难愈性创面治疗的这一难题。现有技术一般采用胶原酶溶解脂肪后离心过滤，对细胞活性有较大影响。

发明内容

本发明提供SVF细胞以及制备方法与应用，得到的SVF细胞存活率高，其中SVF可以称为基质血管成分，优选脂肪基质血管成分。

本发明采用如下技术方案：

SVF细胞及其提取方法，包括以下步骤，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。

本发明的SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。

本发明中，SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到；SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%、透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L，优选的，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸的浓度为1g/L。

本发明中，洗涤后的脂肪为现有技术，本发明的创造性在于提供新的SVF提取试剂，采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高；优选的，洗涤后的脂肪与SVF提取试剂的体积比为1∶1；消化为37℃消化1小时，进一步优选的，消化时振荡。

本发明中，离心处理为450～550g离心4～6分钟；离心分离为250～350g离心2～4分钟；优选的，离心处理为500g离心5分钟；离心分离为300g离心3分钟。