[发明专利]一种通过干细胞体外分化获得人工皮肤的方法及其应用

权利要求书

1.一种干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞60-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；

S2：附着：将脱细胞真皮和间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应器中使用完全培养基进行培养，先在37±1℃条件下震荡培养20-40min，再静置继续培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO₂浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度；

S3：体外诱导脱细胞真皮负载的间充质干细胞向皮肤细胞分化：采用诱导培养液进行换液，所述诱导培养液以KFSM培养基为基础培养基，添加浓度为30-50g/L的黄芪注射液和体积分数为1-3％的胎牛血清。

2.如权利要求1所述的干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，所述培养方法具体包括以下步骤：

S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；所述完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为25μg/ml的人纤连蛋白、浓度为10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为15ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为1％的ITS、浓度为5％的人血白蛋白、浓度为1％的NEAA、浓度为0.1μmol/L的氢化考的松、浓度为0.1％的β－巯基乙醇；

S2：附着：将脱细胞真皮和间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应器中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养30min，摇床转速为50r/min，后停止震荡，静置继续培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度；

S3：体外诱导脱细胞真皮负载的间充质干细胞向皮肤细胞分化：采用诱导培养液进行换液，所述诱导培养液以KFSM培养基为基础培养基，添加浓度为40g/L的黄芪注射液和体积分数为2％的胎牛血清，诱导培养时间为14天。

3.如权利要求1或2所述的干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和宫内膜间充质干细胞。

4.如权利要求3所述的干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，所述脂肪间充质干细胞悬液的制备方法如下：

(1)取脂肪细胞；

(2)将所述脂肪细胞放置于试管内，在试管中加入与脂肪组织量相同体积的消化液，所述消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶-EDTA和0.1％的I型胶原酶，将试管密封，放入37℃的恒温摇床中以190r/Min的速度震荡消化，分为3层；

(3)吸出离心管中的下层液体移入装有完全培养基的新离心管中终止消化，将离心管封闭，离心，分为2层；

(4)用吸管吸取新离心管中的上清后去掉，加入完全培养基，轻轻吹打制成细胞悬液；

(5)将细胞悬液按照0.5×10⁶/ml的密度接种到培养瓶中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；12-24小时后进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代；

(6)吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，再加入消化液消化3-5min，所述消化液为胰蛋白酶-EDTA；轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代。

5.如权利要求4所述的干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脂肪细胞为通过抽脂直接获得的脂肪抽取液。

6.如权利要求3所述的干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脂肪细胞的获取方法为：取脂肪组织挤压进入离心管中，吸取PBS缓冲液加入到装有组织的离心管中，每克脂肪组织使用14mlPBS缓冲液,用吸管吹打10-20次，然后静置0.5-1.5min，用吸管将组织下层的液体吸出，如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止。