[发明专利]一种通过干细胞体外分化获得人工皮肤的方法及其应用

说明书

一种通过干细胞体外分化获得人工皮肤的方法及其应用。本发明提供了一种干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法及应用，该培养方法包括以下步骤：S1：将间充质干细胞传代培养至细胞60‑90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；S2：附着：将脱细胞真皮和间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应器中使用完全培养基进行培养；S3：体外诱导脱细胞真皮负载的间充质干细胞向皮肤细胞分化：采用诱导培养液进行换液，所述诱导培养液以KFSM培养基为基础培养基，添加浓度为30‑50g/L的黄芪注射液和体积分数为1‑3％的胎牛血清，诱导培养时间为14天；TM4SF1和广谱细胞角蛋白表达均呈阳性，获得人工皮肤和组成皮肤组织的细胞更为相似，会起到更好的治疗效果。

技术领域

本发明属于生物组织器官修复技术领域，特别涉及一种干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法及其应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，外伤、烧伤、糖尿病足、肿瘤切除手术等均会造成其损伤。创伤修复一般分为3个相互重叠的阶段：炎性反应期-增生期-重塑期，其中任一阶段失控都会导致病理性愈合，如形成瘢痕疙瘩、伤口延迟愈合或不完全愈合；严重时可造成局部功能受限、失去皮肤屏障作用，引发脓毒症等感染性疾病，威胁患者生命。目前，临床上用于较深或大面积皮肤缺损的修复方法是自体皮片或皮瓣移植。但自体皮片或皮瓣移植面临供皮来源问题，且会造成供区损伤；同种异体皮片或皮瓣移植存在免疫排斥及使用安全性等问题；尤其是当患者全身情况差(如患糖尿病且控制欠佳、全身大面积重度烧伤等)，局部微环境无法为皮片或皮瓣成活提供足够新生血管时，可能导致组织移植失败。在成年哺乳动物，真皮不能自发地再生，在缺少移植存活的真皮基质时，成纤维细胞便开始合成不成熟的基质，基质经重塑形成疤痕。部分疤痕收缩皮肤引起疼痛，部分还会影响相近关节活动，对患者的身心健康都有长期影响。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，该培养方法制得的人工皮肤可进一步减少创面的深度，利用体外分化技术为脱细胞真皮基质补足了缺失的细胞组分，分化获得的皮肤细胞与脱细胞异体真皮构成组织工程学皮肤能够促进创面愈合，加快移植物炎性反应消退；该方法可用于外伤、烧伤、糖尿病足、肿瘤切除手术等均会造成的皮肤损伤。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种干细胞体外向皮肤细胞分化获得人工皮肤的方法，培养方法包括以下步骤：

S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞60-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；

S2：附着：将脱细胞真皮和间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应器中使用完全培养基进行培养，先在37±1℃条件下震荡培养20-40min，再静置继续培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO₂浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度；

S3：体外诱导脱细胞真皮负载的间充质干细胞向皮肤细胞分化：采用诱导培养液进行换液，所述诱导培养液以KFSM培养基为基础培养基，添加浓度为30-50g/L的黄芪注射液和体积分数为1-3％的胎牛血清。

进一步地，该培养方法具体包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为25μg/ml的人纤连蛋白、浓度为10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为15ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为1％的ITS、浓度为5％的人血白蛋白、浓度为1％的NEAA、浓度为0.1μmol/L的氢化考的松、浓度为0.1％的β－巯基乙醇；