[发明专利]一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的建立方法

说明书

本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的构建方法，属于生物技术领域。本发明通过研究赤霉素浓度对幼胚萌发的影响以及活性炭和IBA对幼胚生根影响，建立一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的方法。在建立牡丹幼胚离体快速再生体系的基础上，探究了遗传转化体系最佳条件，建立了农杆菌介导的直接侵染幼胚遗传转化体系，为利用基因工程技术开展牡丹品种改良奠定了一定的基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的构建方法。

背景技术

牡丹是我国常用的观赏和药用植物。其中牡丹籽、牡丹花、牡丹皮均具有较高的应用价值。‘凤丹’牡丹更是因其种子油脂中含有较高的α-亚麻酸，是研究木本油料作物脂肪酸代谢积累的良好材料。但是由于‘凤丹’存在再生困难、遗传背景不清楚等问题，导致‘凤丹’遗传转化体系不成熟，使其在遗传育种改良方面的应用受到一定限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效的‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，使‘凤丹’牡丹幼苗具有萌发快、幼苗长势壮的特点。

本发明的目的还在于提供一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，具有较高的转化率。

本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：

1)‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，得萌发幼胚；

所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；

2)将所述萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行光照培养，得到‘凤丹’牡丹植株；

所述幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45～0.55mg/L GA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭。

优选的，所述幼胚萌发培养基还包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/LNAA，pH值为5.8。

优选的，所述萌发培养的温度为20～25℃，所述萌发培养的时间为25～32d。

优选的，所述幼胚生根培养基还包括以下含量的组分：0.5mg/L GA3、0.5mg/LIBA和0.1mg/L活性炭。

优选的，所述光照培养的温度20～25℃，所述光照培养的时间为28～32d，所述光照培养的光强为6000～8000Lx。

优选的，所述‘凤丹’牡丹幼胚来自当年开花后90d种子。

本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：

A.将含目标基因的植物表达载体转化农杆菌中，依次经筛选培养和扩大培养后，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的MS液体培养基悬浮所述菌体，得到农杆菌侵染液；

所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为250～350μmol/L；

B.以幼胚萌发培养基上培养7～8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8～12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上共培养3～5d，得到共培养幼胚；

所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；

C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系。