[发明专利]一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法

说明书

本发明公开了一种杨树落叶松杨珊锈菌单孢扩繁方法，属于微生物培养技术领域。本发明的方法包括种苗、采集感病叶片和菌种初繁、单孢系转接和扩繁等步骤，包括：使用90mm的一次性培养皿，在培养皿底部垫两张滤纸，加入3mL无菌水进行保湿。将病叶上的单孢子堆用移液枪离散至4μL的琼脂水溶液中，将混有夏孢子堆的溶液打在具有感病能力的NL895的嫩叶上，接种完成后置于温度为19℃，光周期为16h/24h的温室中进行培养，待其发病后在进一步扩繁至足量，保存至4℃冰箱待用。本发明采用室内接种的方法，对锈菌进行叶盘法培养，可获得分离的孢子堆，方法简单高效，为更好地研究杨树抗锈性提供纯化单一的菌株。

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体地说，涉及一种杨树落叶松杨珊锈菌(Melampsora laricipopulina)单孢扩繁方法。

背景技术

杨树在全球有广泛栽培，因其生长快、适应性强，而且品种多，选育时间短，成为了防风固沙林、农田防护林、水土保持林和用材林的主要树种。但是随着大规模杨树人工林的发展，诸多病害随之流行，严重阻碍了杨树的生长。尤其是杨树叶锈病的发生，导致病害在杨树林地传播迅速，给杨树种植园带来巨大损失。导致杨树叶锈病的一种落叶松杨珊锈菌是世界杂交杨树上危害严重的一种病原菌，较成材而言，幼苗和幼树的受害更重，病症为叶背面出现淡黄色粉状物，且引起树苗提前落叶，严重降低其生长量，造成重大经济损失，并且造成树势减弱，使杨树抵御其他病虫害以及自然灾害的能力减弱。

近几年，杨树锈病开始得到广泛的重视和研究，在研究其致病菌杨树落叶松杨珊锈菌时，为获得足量的样本，研究人员通常直接从染病的杨树叶片上刮取大量单孢子堆，由于这是一种混合菌系，对杨树落叶松杨珊锈菌分子遗传相关的研究极为不利，特别是研究其群体遗传时，所用的菌需要获得大量的纯菌系，而现有技术中还没有该病菌的人工大量扩繁其单孢系的良好方法，对该病菌许多研究具有很大的限制和影响。

杨树锈病很多研究需要基于纯的菌系开展，该菌是转主寄主，0、I阶段寄生于落叶松属(Larix)，II、III阶段寄生于青杨派、黑杨派及以这两派为母本的杂交种上。并且只能在活的杨树叶片上存活和繁殖，扩繁单孢系比较困难，国内外也没有报道过落叶松杨珊锈菌单孢系的扩繁。因此现在亟需一套落叶松杨珊锈菌单孢扩繁体系，即得到纯化后的菌系。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，方便快捷高效。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，包括：挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌单孢子堆接种到健康的杨树叶上，繁殖后利用新的健康的杨树叶扩繁，最终获得大量的单孢系孢子粉。

进一步地，所述的杨树落叶松杨珊锈菌的单孢扩繁方法，具体步骤包括：

1)种苗：取三到四周的易感染杨树落叶松杨珊锈菌的杨树组培苗进行炼苗；

2)菌种初繁：摘取步骤1)得到的杨树苗的健康叶片，制成叶盘后用无菌水洗净，挑取染病杨树叶上的落叶松杨珊锈菌的单孢子堆接种到叶盘上培养，每个叶盘上只接种一个单孢子堆；

3)单孢系转接：待叶盘发病后，分别将每个叶盘上生长的孢子挑接到若干个新的叶盘上进行培养；

4)按单孢系收集孢子粉；

5)单孢系喷接扩繁：将收集的孢子粉配制成孢子悬液，以喷雾的形式接种到多个新的叶盘上继续培养，得到足够的孢子粉。

进一步地，所述的叶盘的制备和接种后的培养方法为：摘取炼苗后的杨树苗的叶片，去除主脉切成2×2cm的小方块作为叶盘，无菌水洗净，使叶背面朝上置于培养皿中，培养皿底部预先加入滤纸和无菌水保湿，接种后用封口膜封好培养皿进行培养。