[发明专利]一种共表达羟基类固醇脱氢酶的发酵工艺

权利要求书

1.一种羟基类固醇脱氢酶的工业发酵工艺，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：

摇瓶种子制备步骤：使用LB培养基培养重组酶菌株两次，获得用于发酵扩增步骤的待扩增工程菌；所述重组酶菌株为表达7α-HSDH的工程菌或者表达7β-HSDH的工程菌；7α-HSDH的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，7β-HSDH的蛋白序列如SEQ ID NO:6所示；

发酵扩增步骤：包括一级发酵培养、二级发酵培养和三级发酵培养；在三级发酵培养中，培养基的成分为酵母提取物5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠6g/L,七水合硫酸镁0.5g/L，氯化铵1.5g/L，十二水合磷酸氢二钠8.5g/L，甘油1.5g/L；

培养阶段：将经发酵扩增的工程菌接种于高密度发酵培养基中，获得体积为10000L-30000L的发酵系统，培养条件为：培养温度37℃、搅拌速度100-200rpm、通气量5000-30000L/min、pH 6.0-7.0、溶解氧20％-80％，培养3-5h，培养至发酵液的OD₆₀₀值为10-15，获得发酵系统Ⅰ；所述高密度发酵培养基包括基础成分和微量元素成分；所述基础成分包括：酵母提取物1.75-4.00g/L，蛋白胨3.5-8.0g/L，七水合硫酸镁1.5-2.5g/L，磷酸二氢钾2.5-4.0g/L，氯化铵4.5-8.0g/L，十二水合磷酸氢二钠10.0-15.0g/L，甘油12.5-25.0g/L；所述微量元素成分包括：六水合氯化钙0.01-0.08g/L，四水合氯化亚锰0.01-0.10g/L，六水合氯化铁0.01-0.10g/L；

补料阶段：所述发酵系统的体积用V表示，单位为L；初始培养条件为：以6.0V-7.5Vml/h的速度向发酵系统Ⅰ连续流加补料培养基，培养温度37℃、搅拌速度100-200rpm、通气量5000-30000L/min、pH 6.0-7.0、溶解氧5％-30％，培养至发酵液的OD₆₀₀值为15-25；然后调整补料培养基的流加速度为4.5V-7.5V ml/h，以及调整培养温度为20-25℃，培养至发酵液的OD₆₀₀值为25-35，获得发酵系统Ⅱ；

乳糖诱导阶段：向发酵系统Ⅱ中以4.5V-7.5V ml/h的速度流加补料培养基，并维持乳糖浓度为8-15g/L；乳糖诱导阶段的培养条件为：培养温度20-30℃、搅拌速度100-200rpm、通气量5000-30000L/min、pH 6.0-7.0、溶解氧5％-30％；诱导20h，OD₆₀₀值达到100-150，停止发酵；以50-500L/h的速度向发酵系统Ⅱ流加乳糖诱导剂，并在5h内使乳糖浓度达到8-15g/L，然后维持乳糖浓度为8-15g/L；所述补料培养基的成分为：酵母提取物1.75-5.00g/L，蛋白胨3.75-10.0g/L，甘油200-400g/L，七水合硫酸镁0.25-1.00g/L；所述乳糖诱导剂中乳糖的浓度为200g/L。