[发明专利]一种共表达羟基类固醇脱氢酶的发酵工艺

说明书

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种羟基类固醇脱氢酶的工业发酵工艺，包括诱导发酵培养步骤：待表达工程菌依次通过培养阶段、补料阶段和乳糖诱导阶段表达羟基类固醇脱氢酶；在培养阶段使用高密度发酵培养基，所述高密度发酵培养基包括基础成分和微量元素成分，所述微量元素成分包括钙，二价锰，三价铁。用以解决以乳糖为诱导剂诱导工程菌表达目的蛋白时工程菌增殖速度低、目的蛋白表达量和活性低的技术问题。本方案可以用于牛磺熊去氧胆酸的工业制备中，用以提高牛磺熊去氧胆酸的生产效率和降低生产成本。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种羟基类固醇脱氢酶的工业发酵工艺。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸简称(TUDCA)是名贵中药熊胆汁中所含的主要成分。家禽胆汁中不含有TUDCA，而是以鹅去氧胆酸(TCDCA)为主要成分。TUDCA与TCDCA在结构上是7位羟基的差向异构体，7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶可以催化TCDCA转变成TCDCA。目前7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶都是采用重组工程菌大规模高密度发酵来进行制备。但是现有技术中，7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的制备存在如下问题：乳糖操纵子是目前研究较多的大肠杆菌操纵子，已被广泛应用到原核表达载体的构建中，并且7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的基因的表达大多是由乳糖操纵子控制。乳糖操纵子一般是通过诱导剂IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)来启动，即：在使用重组工程菌来生产7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶时，在发酵过程中的诱导表达阶段，需要使用诱导剂IPTG来启动乳糖操纵子。IPTG虽然是一种高效的诱导剂，但其早已被证实对人体具有潜在的毒性，而且IPTG的造价高昂，因此只适用于实验室小规模蛋白表达时使用，不适合用在工业化大规模生产。该酶7α-羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶将来会被作为一种重要的原辅料用在食品药品的生产加工领域，这两种酶的生产加工过程也必须是安全无毒的，才能满足实际应用的需求。虽然，现有技术中也有尝试使用乳糖代替IPTG来进行工程菌的诱导表达，但是乳糖的加入会导致菌体生长的迟滞、目的蛋白的表达量的减少以及目的蛋白的活性减小。特别是在工业生产中，生产规模往往是以吨级为单位，发酵表达体系庞大，使用乳糖作为诱导剂时，工程菌增殖以及表达目的蛋白的效率受到严重抑制。亟需找到一种既能避免IPTG残留造成的毒性，又能有效促进目的蛋白表达和活性的方法，且该法能够应用于工业放大的生产方法。

发明内容

本发明意在提供一种共表达羟基类固醇脱氢酶的发酵工艺，用以解决以乳糖为诱导剂诱导工程菌表达目的蛋白时工程菌增殖速度低、目的蛋白表达量和活性低的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种羟基类固醇脱氢酶的工业发酵工艺，包括使用乳糖为诱导剂的诱导发酵培养步骤，诱导发酵培养步骤包括培养阶段：使用高密度发酵培养基培养待表达工程菌，所述高密度发酵培养基包括基础成分和微量元素成分，所述微量元素成分包括钙，二价锰，三价铁。

本方案的原理及优点是：使用高密度发酵培养基来培养可表达羟基类固醇脱氢酶的工程菌，通过传代和连续补料充分扩增，以获得大量具有高表达活性的菌体，再经过低温诱导，高效表达羟基类固醇脱氢酶。本方案中添加了微量元素组分，形成了本方案的高密度发酵培养基，可以有效地促进工程菌的繁殖，获得高表达活性的菌体。然后再补加其他培养基，以补充细胞增殖和表达所需的营养物质，最后使用乳糖作为诱导剂来诱导工程菌表达羟基类固醇脱氢酶，可获得大量高活性的目的产物羟基类固醇脱氢酶。其中，可表达羟基类固醇脱氢酶的工程菌可以由现有分子克隆技术，将羟基类固醇脱氢酶基因整合在表达载体上，然后通过转基因进入大肠杆菌中，获得可表达羟基类固醇脱氢酶的工程菌，利用大肠杆菌的蛋白表达系统大量生产羟基类固醇脱氢酶。