[发明专利]耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及O/A型口蹄疫二价灭活疫苗

说明书

本发明公开了耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及O/A型口蹄疫二价灭活疫苗。本发明构建FMDV病毒cDNA感染性克隆质粒，其携带有病毒衣壳耐热表型的分子决定因素、在体内失去复制能力的分子因素、3A和3B蛋白表位缺失的负标记因素及在P1编码区两侧引入Pst I酶切位点，可针对任何流行株替换其衣壳蛋白编码区快速构建并拯救热稳定而且被标记的口蹄疫病毒无毒株，用作口蹄疫灭活疫苗种子病毒。用该通用质粒针对当前两个优势流行株构建两株重组病毒并用其制备O/A型口蹄疫二价灭活疫苗，免疫动物诱导高水平中和抗体并产生免疫保护；用该疫苗接种动物进行抗体检测可实现疫苗接种动物与自然感染动物的鉴别诊断。

技术领域

本发明涉及病毒全长cDNA感染性克隆质粒以及用该全长cDNA感染性克隆质粒拯救获得的重组病毒株，尤其涉及FMDV全长cDNA感染性克隆质粒以及采用反向遗传技术拯救获得的耐热表型稳定遗传、携带3B表位负标记的重组口蹄疫病毒无毒株，本发明进一步涉及该重组口蹄疫病毒无毒株在制备O/A型口蹄疫二价灭活疫苗或者在制备鉴别诊断口蹄疫疫苗接种动物与自然感染动物的试剂中的用途，属于衣壳稳定携带标记重组口蹄疫病毒无毒株的构建及应用领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的，主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病(Grubman and Baxt.2004.Clinical Micro.Rev.17:465-493)。该病在亚洲、非洲和中东的许多国家流行，防疫的财政负担、疾病爆发带来的损失以及国际贸易的限制对流行国家经济社会的影响均是巨大的，无疫国家传入该病常导致灾难性后果。考虑到FMD的高度传染性、对流行国家造成的严重危害以及对无疫国家的巨大威胁，它在国际上被称为政治经济病，历来受到各国政府的高度重视，OIE曾将其列在一类动物传染病的首位。

FMDV属于微RNA病毒科、口蹄疫病毒属的成员，共有七个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3)和数十个亚型，各血清型毒株之间无免疫交叉保护、各亚型毒株之间仅存在部分交叉保护。该病毒基因组为单股正链RNA，全长约为8.5kb，由5'非编码区(5'UTR)、开放阅读框(ORF)和3'UTR组成，其ORF共编码4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和8个非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。

灭活疫苗的免疫接种是流行国家口蹄疫防控的有效手段，无疫国家突然爆发时也常采用环形免疫以减少动物宰杀数量过大造成的损失。然而，口蹄疫灭活疫苗在生产和使用过程中存在四个主要问题，亟待解决：一是，使用强毒株作为生产灭活疫苗的种毒，存在工厂泄露而散毒的风险，一经发生将带来严重后果；二是，病毒发生变异或新的流行毒株传入，会突破原来的免疫屏障导致免疫失败，需要及时更换生产疫苗的种毒，而对于强毒株来说这种更换是受限制且耗时的；第三，口蹄疫病毒146S衣壳易解聚，从而影响疫苗的免疫保护效力以及疫苗的保质期，已有报告通过人工突变提升耐热性的方法可以改善口蹄疫病毒衣壳的稳定性(Abhay Kotecha et al.,nature structuralmolecular biology,2015)，但其耐热表型是不稳定的(Katherine A.Scott et al.,Journal of Virology,2016)；第四，在疫苗制备过程中，口蹄疫病毒的3A、3B等非结构蛋白难以清除干净导致在疫苗中残留，在动物经历多次免疫接种后会诱导产生特异性抗体，使得以非结构蛋白抗体检测为基准的鉴别诊断技术难以区分疫苗接种动物与自然感染动物，这就给口蹄疫免疫防控计划的实施以及活畜贸易中的检疫带来了难题。

有关FMDV减毒的研究，在过去60年里世界上有许多国家做出了巨大努力，虽然取得一些重要进展但一直没能取得成功。无论是用传统的传代适应技术还是用现代的遗传工程技术，FMDV减毒研究均遇到了一个无法克服的障碍，即：产生的减毒表型受动物种属的局限、没能找到对三种主要偶蹄动物猪、牛、羊均减毒的有效方法和途径。已有的口蹄疫病毒基因工程减毒研究主要集中在病毒的非结构蛋白L、3A和3D上，但是均没能解决这一难题。