[发明专利]一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于沙门氏菌的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的se、st、aceA三种检测基因片段，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA 参考样品、制备方法及其应用。

背景技术

沙门菌(salmonella,Sa)属于肠杆菌科，是威胁人类及动物健康的食源性致病微生物，能够引起伤寒、副伤寒、肠胃炎及败血症等严重疾病。在世界各国细菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位。沙门氏菌在日常生活中非常常见，如在生鸡蛋壳、家禽，红肉中，除此之外，被污染的水是全世界沙门氏菌的主要来源。有数据已经证实在发展中国家约有2000万人感染沙门氏菌，同样的在美国，德国等国家也是沙门氏菌的多发地。沙门氏菌的血清型有超过2500种，但是英国的一项调查表明，肠炎沙门菌(salmonellaenteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)感染占到人类Sa 感染患者的75％以上。因此，快速鉴定并确定沙门氏菌的型别，对食品安全具有重要的意义。

目前沙门氏菌的检测方法在不断的快速发展中，聚合酶链式反应(PCR)等核酸检测技术的不断提升一定程度的克服了传统检测方法耗时长、操作复杂、特异性差等缺点。基于核酸的检测特异性强、灵敏度高、快速等优点已成为食源性病原微生物常规的检测方法之一，在食源性病原微生物检测中发挥着重要的作用。但是目前用于PCR的阳性核酸参考品十分缺乏。要同时进行沙门氏菌的鉴定和型别分析，往往要使用多个基因组参考品才能完成，而基因组参考品中检测靶基因的量值，又难以确定和溯源，因此使用基因组DNA作为参考品，缺点是难以同时为多个靶标提供可溯源的定量参考。因此在检测效果和实验室结果评价方面存在严重不足。

质粒DNA参考物质(pDNA)是一类含有所检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，具有稳定性好、准确度高的特点。它不仅可以在核酸的定性检测中作为阳性对照，还可在定量分析中作为定量标准，构建定量分析的标准曲线。因此，质粒DNA参考物质在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示；

其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的se、st、aceA基因的片段插入质粒中形成；

所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；

所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。

进一步地，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

本发明还提供一种上述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：

人工合成沙门氏菌基因se、st、aceA，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；

合成后克隆插入质粒中，经沙门氏菌扩增后，提取并提纯质粒；

测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品。