[发明专利]一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法

权利要求书

1.一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测；

具体步骤为：

(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序的引物；

(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒，所述内标序列如SEQ ID No.4所示；

(3)在样品基因组DNA提取之前，将恒定量的内标质粒添加到样品中，并使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离；

(4)使用病原真菌特异性引物对步骤3)分离的DNA进行PCR共扩增，用于后续样品的建库和测序，所述特异性引物的正向引物的5’端引入8bp的随机DNA片段，作为barcodes序列用于测序后不同样本的分拆，不同样品使用含有不同barcode序列的正向引物，反向引物不含barcode序列；

所述特异性引物序列为：

正向引物Fus-efF：TCCRATGTGCTGACATRCTT，SEQ ID No.1，

反向引物Fus-efR：GCGGCTTCCTATTGACAGGT，SEQ ID No.2，

该引物扩增的区域为引起小麦茎基腐病的假禾谷镰孢菌、黄色镰孢菌和禾谷镰孢菌的TEF-1α基因序列，通过测序分辨不同种类镰孢菌。

2.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，还包括步骤5)将测序获得的样品病原菌丰度通过引入内标reads读数进行标准化，从而定量获得测序样品中病原菌的丰度信息。

3.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，在PCR共扩增过程中引入Barcodes序列，不同样品使用不同的barcodes序列，不同PCR产物混合测样后可以通过barcodes序列对样品进行分拆。

4.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，步骤3)中在样品基因组DNA提取之前，每克样品加入10-500pg内标质粒，之后使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离。

5.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，测样样品建库使用NEBUltra^TMDNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒，建库完成后对文库质量进行检测，质量合格进行上机测序。

6.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：进行测序，得到的PEreads首先根据overlap关系进行拼接，然后根据barcodes序列对样品进行分拆，并对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，将所有优化序列比对至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在99％以上的序列，生成OTU表格，对OTU进行物种注释，使用Blast比对NCBI NT数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息，同时根据内标reads读数，对OUT表进行标准化，根据内标计算每种病原菌在样品中的绝对丰度；

计算公式如下：

OTU_AQ表示病原菌的绝对量，指特定基因拷贝数，

N_AQ表示引入内标的绝对量，指特定基因拷贝数，

OUT表示病原菌reads数

NS表示内标reads数。

7.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，

所述步骤4)中的PCR反应条件为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性10s；45℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环，94-95℃变性10s；55℃退火30s，72℃延伸30s，共15-35个循环；72℃延伸5min，循环结束。