[发明专利]一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法

说明书

本发明公开了一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000‑10000个样品的同时检测，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。该发明可以用于病害在田间土壤、作物等中的定量监测，为预测和预防病害流行、传染提供可靠数据，为病害的早期预测预报提供数据支撑。因此，该方法适用于植物病害诊断和预测预报领域广泛推广应用。

技术领域

本发明涉及真菌定量检测技术领域，特别是涉及一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。

背景技术

植物病害当中真菌是非常重要的一个类群，常引起植株根茎叶部病害，如腐霉菌(Pythium sp.)引起苗腐和猝倒病、丝核菌(Rhizoctonia sp.)引起立枯病，尖孢镰(Fusarium oxysporum)、黄萎轮枝孢(Verticillium alboatum)等引起的萎蔫、枯死等。专业人员可以通过病害症状识别、病原真菌形态和培养性状观察以及生物学特性测定等方法鉴定和鉴别病害的种类，但是，病害症状发生后的识别往往意味着病害已经发生，防治的时效性已经大打折扣，并且这种鉴定方式的准确性和可靠性在很大程度也会因人而异，对形态和生物学特性相近真菌容易造成误判，因此，对研究者的专业技能与分类知识的掌握程度等要求较高，在病害早期诊断、检疫、监测、预测预报和病害防治等方面存在着很大的局限性。

分子诊断技术是植物真菌病害诊断技术的未来发展方向，各种基于PCR的分子检测技术由于具有灵敏、快速及特异等特点，传统PCR技术对模板DNA的来源没有特异性要求，扩增效率高，但扩增过程可能存在污染问题，造成假阳性风险。最后，病原菌在土壤中的密度是其是否具有致病性的衡量标准，而传统PCR技术分子诊断技术对病原菌的定量和定位仍然存在困难；当前尤其是多数量真菌的同时检测技术和定量技术的发展为该技术的完善注入了新的活力，基于荧光定量PCR定量检测技术多限于对一个目标病原真菌的检测，灵敏度高、快速、单一性强，但缺少多数量性，同时易污染，造成假阳性风险。

高通量测序可以揭示样品中真菌菌群的多样性，并获得特定类群真菌在群落中的相对丰度，但是却无法根据reads估算出其绝对丰度和变化，因此，对样品中病原菌诊断存在无法准确定量的问题。

发明内容

本发明就是针对目前植物真菌病害诊断中传统诊断方法和分子诊断技术存在的问题而提供一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。本发明在高通量测序过程中引入了内标质粒，实现了对待测样本的定量检测，可以一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，其最大的优点在于高通量，依据测序深度的提高可以实现1000-10000个样品的同时检测，适用于农技部门对植物真菌、细菌等病害在田间土壤、作物等中的定量监测。

本发明的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法技术方案为，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测。

所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，具体步骤为：

(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序引物；特异性引物扩增目标区域可以有效识别种水平上的变异特征；

(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒；

设计合成内标质粒，具有以下特征：

(a)含有病原真菌特异性引物结合位点，并能利用特异性引物PCR扩增出GC含量和长度与目标病原菌基因相似的DNA片段；

(b)内标质粒方便提取能够大量获得。