[发明专利]检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法

权利要求书

1.一种用于检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞分化功能的方法，其特征包括以下步骤：

步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述大鼠腹腔注射一针乙烯二甲基磺酸盐(Ethylene dimethanesulfonate：EDS，80毫克/公斤体重)，四天后从所述SD大鼠睾丸中分离生精小管和SLCs；

步骤二，生精小管的培养与处理：将生精小管分成多组，并添加不同浓度(0-100μM)的MEHP，在34℃和5％CO2的条件下培养生精小管4周；在第一周末，于部分生精小管培养基中加入10μM EdU标记24小时，检测细胞增殖活性；显微镜下计数生精小管表面阳性细胞，并表示为每平方单位的阳性细胞数目；其它的生精小管，继续培养至第四周末，行HSD3B酶活性染色，以检测MEHP对小管表面的SLCs分化成Leydig细胞的影响，或抽提蛋白，进行WesternBlots(WB)分析Leydig细胞相关蛋白表达；

步骤三，CD90+SLCs的培养和处理：以步骤二获取生精小管行胶原酶处理得单细胞悬液，然后行流式分选，获取CD90+SLCs。体外扩增CD90+SLCs，采用用不同浓度(0-100μM)的MEHP处理7天，再加入10μM EdU标记24小时，显微镜下计数EdU阳性及DAPI染色的总细胞核并计算阳性率；其它细胞继续培养，铺满度达到90％时，将其置于Leydig细胞分化诱导培养基(LIM)或脂肪细胞诱导培养基(AIM)中，同时添加不同浓度(0-100μM)的MEHP 3周；实验完成后，对细胞进行HSD3B活性及Oil-Red O染色，阳性细胞计数；另外，以qPCR分析Leydig细胞基因及成脂基因表达情况，以评估MEHP对SLCs分化成Leydig谱系及脂肪细胞谱系的影响。

2.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤一中，所述动物饲养条件是温度保持为22℃，并于每12小时进行一次光暗切换，以模仿昼夜交替。

3.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤一中，所述EDS由80mg/kg BW溶解在DMSO：PBS为1：3的溶剂中制得。

4.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤二中，所述生精小管培养基设置为1∶1混合的M199和DMEM/F-12，并添加有15mM HEPES，2.2mg/ml碳酸氢钠，0.1％BSA，青霉素/链霉素(100U/ml/100μg/ml)，1XITS和10ng/mlLH。

5.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤二中，所述生精小管表面EdU阳性细胞计数时，单位平方边长设置为与生精小管直径相同。

6.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤二中，所述生精小管培养基更换周期为3-4天，所述生精小管培养基在更换后，在-20℃条件下保存，进行睾酮测量；并由液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定睾酮和5α-雄烷二醇的水平。

7.根据权利要求1所述的一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法，其特征在于：步骤三中，在CD90+SLCs分化期间，每次收集对应培养基进行睾酮分析。