[发明专利]检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法

说明书

本发明公开了一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法。通过培养生精小管和分离的SLCs验证了邻苯二甲酸单‑(2‑乙基己基)酯(MEHP)对SLC功能的影响。发现MEHP会影响SLCs形成Leydig细胞的效率以及相关的特异性基因表达，其中包括Lhcgr，Scarb1，Hsd3b1，Cyp17a1，Star，Srd5a1，Akr1c14，Insl3，Hao2和Pah。由于SLCs是多潜能的，本发明还发现了当MEHP与脂肪细胞分化培养基共用，可以强烈促进多个脂肪形成相关基因的表达，例如Pparg和Cebpa，从而显著提高SLCs形成脂肪细胞的活性。本发明发现MEHP抑制SLCs分化为Leydig谱系，同时促进SLCs分化为脂肪细胞。

技术领域

本发明涉及生物化学试验技术领域，具体是一种用于检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化，促进其向脂肪细胞分化的方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯是一组合成化学物质，广泛应用于消费品和工业环境，具体包括医疗设备、食品包装、家具、服装、清洁材料和汽车等产品。目前通过医学研究发现，邻苯二甲酸酯的使用可能会引发男性生殖系统疾病，例如隐睾症、尿道下裂、精液质量变差等，甚至会引发睾丸癌，这些症状被统称为睾丸发育不全综合征。在体内，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(DEHP)会被快速代谢为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(MEHP)，MEHP被认为是影响体内生殖功能的主要形式。在雄性生殖系统中，MEHP的主要靶标是Leydig细胞。并且在实验动物研究中发现，在妊娠期或青春期接触DEHP会显著影响胎儿和成年Leydig细胞的发育。但是，目前邻苯二甲酸盐影响Leydig细胞发育的机制知之甚少，尤其是MEHP 是否直接作用于正在发育的Leydg干细胞(SLCs)，目前尚不清楚。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检验邻苯二甲酸盐抑制间质干细胞向Leydig细胞分化的方法。该方法操作简单，可以有效证明MEHP具有抑制SLCs分化为Leydig谱系，同时刺激SLCs分化为脂肪细胞的潜能。

为实现上述目的，本发明提供的实验步骤如下：

步骤一，试验动物的处理：选用雄性90天龄SD大鼠，腹腔注射一个剂量EDS(80mg/公斤体重)，四天后从所述SD大鼠睾丸中分离生精小管和SLCs；

步骤二，生精小管的培养与处理：将生精小管分成多组(24孔培养板)培养，并加入不同浓度梯度(0-100μM)的MEHP，在34℃和5％CO2的条件下培养4周。为评估MEHP对SLCs增殖的影响，在培养的第一周末于部分小管中加入10μM EdU标记24小时，然后利用Click-iT^TM方法染色EdU阳性细胞。定量分析EdU阳性细胞，以评估MEHP对SLCs增殖潜能的影响。定量方法是在显微镜下沿生精小管表面计数阳性细胞数量，并表达为每平方单位所含的阳性细胞数。其余小管继续培养分化至第4周末，完成培养后，直接对生精小管行HSD3B酶活性染色，以检测SLCs形成Leydig细胞的效率。或利用涂有多聚赖氨酸的培养载玻片小室板继续培养小管，使其表面的脂肪细胞黏附于载玻片表面，进行Oil-Red O染色脂肪细胞，以评估 SLCs形成脂肪细胞的效率。其它生精小管抽提蛋白，作WB检测 Leydig细胞或脂肪细胞相关蛋白。培养基收集-20C保存，测定雄激素浓度。