[发明专利]以CARDS基因为靶标利用MCDA-LFB检测肺炎支原体的方法

说明书

本发明公开了CARDS基因为靶标利用MCDA‑LFB检测肺炎支原体的方法。所述方法还包括能够针对肺炎支原体CARDS基因进行特异性扩增的MCDA扩增引物组，所述MCDA扩增引物组由序列1‑序列10所示的核酸分子组成。本发明提供的检测方法可以在40分钟内完成整个MCDA扩增，在其对肺炎支原体的特异性基因CARDS的检测中，检测下限可以低至100fg，具有非常高的灵敏度。另外，本发明提供的检测方法具有很高的扩增特异性，能准确地鉴别肺炎支原体与其它病原菌，无假阳性及假阴性结果产生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及以CARDS基因为靶标利用MCDA-LFB检测肺炎支原体的方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是儿童社区获得性肺炎的常见病原体，近年来发病率呈上升趋势，可引起局部地区流行，引起肺炎，并产生肺不张、胸腔积液等肺内及中毒性脑病、肝损等肺外并发症。

目前MP的诊断方法主要有3种：分离培养法、血清学检测法、分子生物学检测法。分离培养是诊断MP感染的“金标准”，但由于培养阳性率低，培养条件苛刻，实验室要求比较高、对技术人员要求比较严格，并且MP生长缓慢，缺乏早期诊断价值。血清抗体检测作为目前临床主要的实验室检测方法，易受患儿病程、年龄和免疫状态的影响，出现假阴性或假阳性结果。急性期和恢复期双份血清升高，是目前血清学诊断的主要标准，但恢复期血清难以获取，限制了血清学检测在临床上的应用。近年来，核酸检测技术因其较高的诊断准确性和简单快速的优点，被逐渐应用于临床MP的实验室诊断，但是该检测方法依赖精密复杂的仪器，昂贵的探针，对实验室条件和技术人员要求比较高，因此该检测方法不适用于基层医院。

目前MP核酸诊断的靶基因主要以P1基因和23SrRNA最为常见。近年来新发现的可以编码MP致病毒素--社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(Community-acquired respiratorydistress syndrome toxin，CARDS TX)的基因逐步受到人们关注。CARDS TX是由MP产生的大小约为68kDa的毒素蛋白，由MP基因MPN372编码，共有591个氨基酸组成。CARDS TX第1-239位氨基酸和百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)的S1亚单位存在27％的同源性。CARDSTX在感染早期高表达，参与了MP的入侵和致病。

为了克服传统PCR检测的不足，以恒温扩增技术为基础的核酸诊断技术迅速发展。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，仅需要水浴锅或简单的PCR仪即可，并且恒温扩增核酸诊断技术具有特异性和敏感性高、操作简单、反应迅速的优点，因此恒温扩增技术可广泛用于各医疗机构。迄今为止，恒温扩增技术已有10余种，目前应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温扩增技术依赖多种酶同时工作，试剂昂贵、操作复杂。为克服PCR技术和现有的恒温扩增技术的劣势，实现简单、快速、灵敏、特异的核酸诊断，发明人近期新建了一种核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple CrossDisplacement Amplication，MCDA)。此外，为了进一步提高MCDA技术的推广价值，发明人还将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术，实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple Cross Displacement Amplification label-based Nanoparticles LateralFlow Biosensor，MCDA-LFB)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供用于检测或辅助检测肺炎支原体的成套引物组。

本发明提供的用于检测或辅助检测肺炎支原体的成套引物组由引物1-引物10组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：