[发明专利]植物瞬时表达载体的构建及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域领域，特别涉及植物瞬时表达载体的构建及应用。本发明采用人工合成的序列来提高载体的转录量，同时通过选择性地添加氨基酸序列来提高目标蛋白的翻译水平和稳定性，最终在整体上达到提高目标蛋白在植物叶片细胞积累量的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，特别涉及植物瞬时表达载体的构建及应用。

背景技术

植物表达系统与哺乳动物细胞表达系统、微生物发酵系统一样，是一个具有广阔应用前景的生物蛋白表达反应器。哺乳动物细胞表达系统具有产量高、体系成熟、与人类细胞相近等优势而被普遍推广，但运行价格相对昂贵；微生物发酵系统技术也相当完备，同时产量高、价格低廉，但由于细胞种类的差异，微生物发酵系统并不能很好地表达需要特定蛋白修饰的目的蛋白。植物表达系统具有先天的优势，比如植物的生物量限制少、生长快、成本低与哺乳动物表达系统，同时植物细胞能够对蛋白进行各种翻译后修饰，可以弥补微生物发酵系统及昆虫表达系统的不足，具有良好的生产前景，是商业应用是一个比较热门的研究方向。

在植物内进行目标蛋白表达，一个有效的植物外源蛋白表达载体是至关重要的。当前阶段，国内植物外源蛋白表达载体主要的应用在处于基础科研领域，对于能够进行高效商业生产的应用载体的探索还很少。国际上植物重组蛋白表达企业Medicago和IconGenetic都根据基础研究和自身研究进展开发了独有的表达载体。因此，通过基因工程的手段来改造和提升植物外源表达载体的表达效率，使其能够满足商业生产目标蛋白的需要，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了植物瞬时表达载体的构建及应用。本发明采用人工合成的序列来提高载体的转录量，同时通过选择性地添加氨基酸序列来提高目标蛋白的翻译水平和稳定性，最终在整体上达到提高目标蛋白在植物叶片细胞积累量的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物瞬时表达载体，包括5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述5’UTR区域、MCS区域和SEKDEL序列的序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体以植物表达载体pEAQ为基本骨架。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体还包括目的基因，所述目的基因的N端增加PacI酶切位点，C端增加XhoI酶切位点。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的植物瞬时表达载体的构建方法中，采用如SEQ ID No.2所示的上游引物和如SEQ ID No.3所示的下游引物扩增如SEQ ID No.1所示的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的扩增体系包括22μl ddH₂O、25μlKOD OneTM PCRMasterMix、1μl 10μM如SEQ ID No.2所示的上游引物、1μl 10μM如SEQ IDNo.3所示的下游引物、1μl 100ng/μl的含有人工合成序列SEQ ID No.1的质粒模板。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增的程序为：98℃30秒；28个循环：98℃10秒；55℃30秒；68℃10秒；68℃5分钟；4℃10分钟。

本发明还提供了所述的植物瞬时表达载体在表达外源蛋白中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外源蛋白包括GFP。

在上述研究的基础上，本发明还提供了植物瞬时表达载体表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤1：构建所述的植物瞬时表达载体；

步骤2：在步骤1制得的所述植物瞬时表达载体中插入外源蛋白的基因；获得重组质粒；