[发明专利]基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR技术的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括信号放大磁珠技术系统和等温扩增引物；所述信号放大磁珠技术系统包含报告磁珠，所述报告磁珠由羧基修饰的磁珠、ssDNA和链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶组成，所述ssDNA分子的两端分别用氨基和生物素标记，所述报告磁珠具体结构为磁珠（羧基）/5’氨基-AATGGCAAATGGCA-3’Bio/SA_β-Gal，所述的报告磁珠的构建方法包括以下步骤：将磁珠与ssDNA通过共价键方式连接得到ssDNA-磁珠，通过链霉亲和素和生物素将β-半乳糖苷酶和ssDNA-磁珠连接得到；所述等温扩增引物包括RPA-F引物：GGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC，RPA-R 引物：GATGTCAAAAGCCCTGTATACGACATCAGTAC；所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和crRNA，所述crRNA 序列为：AGACGGGCUGCACUUACACCG。

2.一种基于CRISPR技术的超高灵敏度核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将病毒液进行热灭活和裂解，释放病毒的RNA分子，使用纳米核酸磁珠提取病毒悬液中RNA分子，将提取磁珠加入RT-PRA等温扩增的反应体系中，对靶分子进行RT-RPA扩增，获得第一级的信号扩大；所述病毒液为假病毒液，所述假病毒为2019-nCOV假病毒；所述RT-RPA等温扩增采用的引物包括RPA-F引物：GGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC，RPA-R 引物：GATGTCAAAAGCCCTGTATACGACATCAGTAC；

2）将第一级的信号扩大获得的DNA分子使用原来的纳米磁珠进行第二次提取，并将DNA分子加入到包含具备旁切割活性的Cas12a蛋白的反应体系中特异性识别切割病毒靶DNA分子，并激活Cas12a蛋白的非特异切割活性，启动第二级的信号放大，其中与Cas12a蛋白结合的crRNA序列为：AGACGGGCUGCACUUACACCG；

3）在反应体系中加入报告磁珠：磁珠（羧基）/5’氨基-AATGGCAAATGGCA-3’Bio/SA_β-Gal，具备旁切割活性的Cas12a非特异切断ssDNA释放游离的β-半乳糖苷酶到体系上清中，使用磁铁吸附所有的磁珠，取出含有游离β-半乳糖苷酶的上清加入荧光底物反应，使用酶标仪进行读数检测，得出检测荧光信号；

其中，所述报告磁珠由羧基修饰的磁珠、ssDNA和链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶组成，所述ssDNA分子的两端分别用氨基和生物素标记，所述报告磁珠具体结构为磁珠（羧基）/5’氨基-AATGGCAAATGGCA-3’Bio/SA_β-Gal，所述的报告磁珠的构建方法包括以下步骤：将磁珠与ssDNA通过共价键方式连接得到ssDNA-磁珠，通过链霉亲和素和生物素将β-半乳糖苷酶和ssDNA-磁珠连接得到。