[发明专利]基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用

说明书

本发明公开了一种报告磁珠，所述报告磁珠包括磁珠、核苷酸和高催化活性的酶相链接。本发明还公开了基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统，本发明还公开报告磁珠的构建方法以及应用。本发明通过引入报告磁珠，将信号放大磁珠技术系统的灵敏度从aM（1000‑10000 copies/mL）浓度级别提高到zM（1‑10 copies/mL）浓度级别。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于CRISPR技术的核酸检测的信号放大磁珠技术系统及其应用。

背景技术

CRISPR核酸检测技术可以用于植物、动物、微生物、病毒等来源的DNA或RNA分子的检测。目前用于CRISPR核酸检测的蛋白有Cas13a、Cas12a、Cas14、Cas12b、Cas13b、Csm6等具有旁路核酸切割活性的Cas蛋白。

Cas13a蛋白分子：识别特异性的单链RNA分子，激活旁路核酸切割活性，非特异性地切割任意单链RNA分子。

crRNA核酸分子可以和Cas13a蛋白分子结合，形成crRNA-Cas13a复合体。当crRNA核酸分子与目标RNA分子匹配时，Cas13a会对目标RNA进行特异性切割，并因此而激活Cas13a的旁路核酸切割活性，对所遇到的任意单链RNA分子进行高效的非特异性切割。一个目标RNA分子可以激活一个Cas13a蛋白，激活后的Cas13a蛋白可以切割大量的任意单链RNA分子。利用Cas13a蛋白的这个特点可以用于特异性的检测某一段RNA序列。针对目标RNA分子，设计特异性结合的crRNA。反应体系中加入待检测的RNA分子，特异性的crRNA分子，Cas13a蛋白分子，以及报告RNA分子。常用的一种报告RNA分子是一段寡核苷酸：一端附有一个荧光基团(HEX)，另一端有一个淬灭基团(BHQ1)。由于淬灭作用，一个完整的报告RNA分子不会发出荧光。当待检测的RNA分子与crRNA-Cas13a匹配时，crRNA-Cas13a才会对待检测的RNA分子进行特异性切割，并激活Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)，进而切割报告RNA分子，使荧光基团摆脱了淬灭基团的作用，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出是否有目标RNA分子的存在。假如体系中不存在目标RNA分子时，报告分子的荧光基因不会亮。只有当体系中存在目标RNA分子，Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)被激活，荧光素摆脱了淬灭基团的作用，才能发出荧光信号。其检测灵敏度可以达到nM(10^-9M)浓度级别。

为了提高检测灵敏度，需要在进行Cas13a反应前先将待检测分子进行核酸扩增，常用的核酸扩增的方法有：RPA扩增、LAMP扩增、PCR扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2等。经过扩增富集后的待检测分子再进行Cas13a反应，其检测灵敏度可以达到aM(10^-18M)浓度级别，也就是1000-10000copies/mL。

Cas13a蛋白可以用于检测RNA分子，也可以用检测DNA分子。如果待检测分子是DNA，DNA分子经过RPA扩增富集得到大量的双链DNA分子。如果待检测分子是RNA，RNA经过逆转录成为cDNA后再经过RPA扩增(RT-RPA)富集得到大量的双链DNA分子。经过RPA扩增或者RT-RPA扩增后，待检测分子得到大量富集，变成双链DNA分子，这是第一轮信号放大。双链DNA分子经过体外转录(如：T7转录)变成单链RNA分子。当单链RNA分子与crRNA-Cas13a匹配时，crRNA-Cas13a对RNA分子进行特异性切割，并激活Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性(旁路核酸切割活性)，进而切割报告RNA分子，使荧光基团摆脱了淬灭基团的作用，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出是否有目标分子的存在。一个Cas13a分子可以切割大量的报告RNA分子，这是第二轮信号放大。通过两轮的信号放大(核酸扩增+Cas13a切割)，检测灵敏度可以达到aM(10^-18M)浓度级别，也就是1000-10000copies/mL。

其流程为：