[发明专利]一种内标组合物及其在检测动物病原微生物中的应用

权利要求书

1.一种内标组合物，其特征在于，所述内标组合物包括含内标基因序列的质粒和用于扩增所述内标基因序列的引物探针组合；其中，所述内标基因序列为增强型绿色萤光蛋白的保守基因序列。

2.根据权利要求1所述的一种内标组合物，其特征在于，所述内标基因序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种内标组合物，其特征在于，所述引物探针组合包括如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列的第一内标引物对或如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列的第二内标引物对；和/或，如SEQ ID NO.5所示序列的内标探针。

4.根据权利要求3所述的一种内标组合物，其特征在于，所述内标探针在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团；其中，所述内标探针上的荧光报告基团与待检测目的基因的探针上的荧光报告基团不同。

5.一种如权利要求1～4中任一项所述的内标组合物作为检测动物病原微生物的内标的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一内标引物对和内标探针用于检测单一动物病原微生物，所述第二内标引物对和内标探针用于检测多种动物病原微生物。

7.一种基于非诊断目的的采用如权利要求1～4中任一项所述的内标组合物检测动物病原微生物的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)将含内标基因序列的质粒添加到含样品的荧光PCR反应体系中；

步骤2)在所述反应体系中，采用第一内标引物对和内标探针或第二内标引物组合物和内标探针进行内标基因的扩增，同时采用引物和探针进行样品目的基因的扩增；

步骤3)对扩增结果进行分析。

8.根据权利要求7所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述扩增结果的分析为：当样品中含有目的基因时，内标基因与目的基因均有S型扩增曲线，检测结果为阳性；当样品中不含有目的基因时，只有内标基因有S型扩增曲线，检测结果为阴性；当无任何S型扩增曲线时，检测结果即为假阴性。

9.一种含有内标基因序列的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A.选取内标基因序列：增强型绿色萤光蛋白的保守基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示；根据所述内标基因序列设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列的第一内标引物对或如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列的第二内标引物对以及如SEQ ID NO.5所示序列的内标探针；

步骤B.将合成的含内标基因序列的DNA片段与质粒载体连接，转化大肠杆菌，筛选大肠杆菌阳性克隆；

步骤C.利用所述第一内标引物对和内标探针或所述第二内标引物对和内标探针对所筛选的大肠杆菌阳性克隆进行荧光PCR检测，以构建含内标基因序列的质粒。

10.一种用于检测动物病原微生物的试剂盒，其特征在于，包括检测试剂和如权利要求1～4中任一项所述的内标组合物。