[发明专利]一种内标组合物及其在检测动物病原微生物中的应用

说明书

本发明公开了一种内标组合物，其包括含内标基因序列的质粒和用于扩增所述内标基因序列的引物探针组合，具体地，所述内标基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物探针组合包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列的第一内标引物对或如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列的第二内标引物对和如SEQ ID NO.5所示序列的内标探针。本发明还涉及上述内标组合物在检测动物病原微生物中的应用，以及上述含内标基因序列的质粒的构建方法。本发明将所构建的内标组合物添加到样品中进行核酸抽提或直接添加到荧光PCR反应体系中，可有效监测核酸提取和产物扩增出现的误差，避免假阴性的发生，从而提高荧光PCR检测的准确率，为动物病原微生物的检测提供有效可靠的技术手段。

技术领域

本发明涉及动物病原微生物检测技术领域，尤其涉及一种内标组合物及其在检测动物病原微生物中的应用。

背景技术

实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，且克服常规PCR不能准确定量和易污染引起假阳性的问题，已被广泛应用于动物病原微生物的检测。以往在动物病原微生物的检测很少用到内标。然而，近些年来的研究表明，采用实时荧光PCR方法检测动物病原微生物时，常常会受到来自环境因素和样品中理化性质的干扰，特别是一些能够阻碍PCR反应的抑制物，会使检测结果呈假阴性。在实时荧光定量PCR检测中，假阴性一般是由于PCR扩增失败导致的，如提取过程中靶基因的丢失、提取试剂残留、标本中抑制物去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等。现有技术中，避免假阴性最有效的措施是建立“内标”。研究表明，复杂的动物样品成分(组织、血液、唾液、粪便等)，培养基成分以及残留的核酸提取试剂等抑制因子，可能会对实时荧光定量PCR反应产生抑制作用，影响检测结果的准确性。因此，在检测体系中添加用于监测核酸提取或指示反应抑制情况的内标则显得尤为重要。动物样品中病原微生物荧光定量PCR检测技术体系中的内标对于确保检测结果的可靠性具有重要的作用，一个可靠、有效的动物病原微生物检测方法必须包含有可以指示假阴性结果的内标，可有效监测核酸提取、扩增中出现的误差，从而避免假阴性结果。

制备内标的方法有很多，根据不同的实验目的和要求采用不同的制备方法。初期的内标是利用克隆技术将目的序列的PCR产物通过插入、删除或者替换等手段处理后制备的，制备方法较繁琐且制备的内标仅能用于单一病原微生物的检测。因此，需要开发出一种通用的异源性内标用于不同目的基因的动物病原微生物的检测，不仅可以用于单一病原微生物的检测，而且还可以用于多个病原微生物的检测。

增强型绿色萤光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)是水母体内的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因经改造后的突变体，在蓝色450～490nm波长范围的光线激发下，显示绿色萤光，比通用的GFP荧光显示程度更强，检测灵敏度更高。作为良好的标记和报告基因，GFP基因应用范围非常广泛。目前GFP及其突变体eGFP作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的缺陷，本发明提供一种内标组合物及其在检测动物病原微生物中的应用，其选取eGFP的一段保守基因序列，由于序列来源于发光水母基因，与GenBank数据库中所收录的动物病原微生物基因组没有任何同源性，防止与目标基因同时检测时出现非特异性扩增，因此其可作为一种通用的异源性实时荧光定量PCR内标以用于不同目的基因的动物病原微生物的检测，将内标组合物应用于荧光定量PCR，以有效监测核酸提取、荧光PCR扩增中出现的误差，从而避免假阴性的结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种内标组合物，其包括含内标基因序列的质粒和用于扩增所述内标基因序列的引物探针组合；其中，所述内标基因序列为增强型绿色萤光蛋白(eGFP)的保守基因序列。