[发明专利]一种神经脱细胞预处理方法

说明书

本发明提供一种神经脱细胞预处理方法，所述方法首先通过高渗溶液和低渗溶液交替处理对细胞进行初步裂解，再利用单向冷冻干燥技术得到具有微通道的神经，进一步进行轴向穿刺，得到内部形成大通道的神经。神经经过预处理后，使用浓度较低的温和去污剂就能实现脱细胞效果，且对神经ECM分子破坏性较小。通过上述方法脱细胞得到的神经与传统Sondell脱细胞法制备得到的神经相比，其能更加有效的支持施万细胞渗入和迁移，具有更好的生物相容性，且作为移植物具有更好的神经修复效果。

技术领域

本发明属于神经生物学技术领域，具体涉及一种神经脱细胞预处理方法以及涉及所述预处理方法的一种神经脱细胞方法。

背景技术

周围神经是联络中枢神经和其它组织器官的重要神经结构，但是，临床上每年全球范围内有数百万人遭受周围神经损伤，由于预后不佳，对患者致残率较高。周围神经损伤往往伴有神经完整性的破坏，乃至神经缺损，导致早期无张力的直接缝合无法实施，这时就需要应用移植物来连接神经断端，恢复神经连续性。目前，自体神经移植被认为是修复周围神经缺损的“金标准”，在临床上应用广泛。然而，自体神经来源有限，且可供移植的神经均为皮神经，此外，当神经缺损长度大于7cm或者患者年龄大于50岁时，自体神经移植的修复成功率明显下降。这些因素极大的限制了自体神经的临床应用。

随着生物材料学和组织工程学的不断发展，大量组织工程神经被研发出来，如中空型神经导管。中空型神经导管可以在损伤神经的断端之间形成相对密闭的再生微环境，但是，中空型导管的内部缺乏新生细胞和轴突定向迁移和延伸所需的引导性因素，使新生轴突排列紊乱和错位愈合，难以获得满意的神经修复效果。而且，中空型神经导管主要用于修复长度小于2mm的神经缺损。

除此之外，脱细胞异体神经因为其特有的优势，有望成为自体神经可能的替代物，近来受到相关学者的广泛关注。异体组织移植的主要问题在于免疫排斥反应，会对神经再生造成极大的不利影响，最终导致移植物的排异和修复失败。神经经过脱细胞处理后，施万细胞、血管内皮细胞、束膜细胞等细胞性成分以及神经轴突与髓鞘等结构性成分均被去除，可以获得以基底膜管为主要结构的天然神经ECM(细胞外基质)三维支架。这种脱细胞基质成分的抗原性极小，大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。

为了制备脱细胞神经，近年来研究者开发了多种方法。目前，最为学界认可的是Sondell方法和Hudson方法，其作为常规神经脱细胞方法被广泛使用。Sondell方法具体是通过TritonX-100和脱氧胆酸钠反复处理以达到去除细胞性成分的目的。研究表明此方法可能获得较好的脱细胞效果，但是由于离子型强效去垢剂脱氧胆酸钠的应用，使得制备的脱细胞神经往往伴有细胞外基质成分和结构的较大破坏。为了更好地制备脱细胞神经，Hudson等人提出了一种基于TritonX-200、SB-10和SB-16的改良脱细胞方法，但是，近年来Hudson方法中关键试剂TritonX-200已经停售，并且这种试剂也难以自行稳定而有效地合成，因而使得此方法在进一步科研分析以及临床诊治中的应用受到极大限制。

另外，上述神经脱细胞方法均是对正常神经进行洗脱，正常神经的内部微结构比较致密，孔隙率较低，孔隙直径较小，因此就需要浓度较大的去污剂进行洗脱，或者对神经进行长时间多次洗脱，这会对ECM造成较大的破坏。此外，不足的孔隙率和较小的孔隙直径还难以满足再生细胞的渗透和迁移的需要，并使种子细胞加载变得困难，导致细胞黏附率及分布均匀度不佳。上述问题均会影响神经修复效果。

为了解决上述问题，本发明提供一种神经脱细胞预处理方法，经过所述方法预处理后再进行脱细胞，能实现更好的神经脱细胞效果，且对ECM造成的破坏更小。与传统Sondell脱细胞法制备得到的神经相比，本发明提供的神经脱细胞法制备得到的神经能更加有效的支持施万细胞渗入和迁移，且具有更好的生物相容性，神经修复效果更佳。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种神经脱细胞预处理方法，本发明的另一个目的是提供一种神经脱细胞方法，所述方法使用温和去污剂就能达到较好的脱细胞效果。本发明还有一个目的是提供一种基于所述脱细胞方法制备的神经及其用途。