[发明专利]一种利用转分化技术诱导体细胞重编程至神经细胞模型的方法

说明书

本发明提供了一种利用转分化技术诱导体细胞重编程至神经细胞模型的方法，具体为，通过神经细胞发育关键转录因子组合将精神分裂症患者的皮肤成纤维细胞直接转分化为神经细胞。本发明的优点在于能从将体细胞成功转分化为神经细胞，且转分化效率高，可以建立较为精准的细胞模型且可以模拟精神分裂症的神经发育过程，为进一步研究精神分裂症的发病机制提供一种新的可能性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为涉及一种利用转分化技术诱导体细胞重编程至神经细胞模型的方法。

背景技术

中枢神经系统损伤包括脑损伤、脊髓损伤或神经退行性疾病等，目前中枢神经系统损伤或退行性病变的治疗仍是世界级的医疗难题，临床上对神经损伤的主要治疗方法包括手术除去病因、避免继发性损伤、保护残存神经元功能及后期康复治疗等，然而这些方法对于神经再生的作用微乎其微，其预后效果仍然很差，这是由于神经元再生功能低下，损伤区域与正常组织之间有瘢痕组织增生的屏障存在等不利因素有关。因此，如何促进神经细胞再生、突破再生屏障是目前神经科学家及临床研究工作者的重要焦点。

目前促进神经细胞再生的方法主要包括：

1、通过传统诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)诱导，即将体细胞诱导为干细胞再向神经元或前体细胞转化，由iPS诱导分化而来的中枢神经系统细胞具有用于各种疾病的自体细胞替代治疗潜力。然而使用iPS存在以下问题：(1)需要及时准备一定数量的iPS,而准备神经移植的患者往往无法等待这种干细胞在体外进行诱导、分化、筛选等准备时间较长的过程；(2)iPS细胞的诱导转化率低，需要进行再次增殖，而在此过程中具有分化的不确定性；(3)用来移植的未分化干细胞，如果未及时分化会在体内增加肿瘤形成的风险。

2、通过体细胞的体外直接诱导分化。近几年，有大量学着实验中发现，部分细胞可以在慢病毒和逆转录病毒等载体的介导下，通过转录因子对细胞的重编程直接诱导成为体细胞，越过了干细胞阶段，极大的减少了二次诱导分化所需要的时间及不确定性。目前，已有研究人员将星形胶质细胞中分别转入Neurog2和Dlx2两种因子，证实星形胶质细胞分别在这两种因子的作用下，可直接被诱导为成熟神经元，且能在这些分化的神经元之间形成突触结构。此外，还有研究发现，成纤维细胞在内、外因素的共同影响下，具有直接转化为胆碱能神经元的能力。进行深入研究后，发现成人的皮肤成纤维细胞可以不经过诱导多能干细胞阶段，直接和高效地转化为高纯度运动神经元。然而，研究人员在临床转化过程中发现，干细胞疗法均取材于患者本身的细胞，但来自于患有精神系统疾病(如肌萎缩侧索硬化症、精神分裂症等)的患者的成纤维细胞相对于正常人的成纤维细胞转化后的生存能力较差，并且在成纤维的诱导分化过程中，总是会存在部分细胞分化不确定性的问题，这些问题均导致了用于神经类疾病的干细胞疗法在实际应用的困难。

发明内容

为了解决现有技术中来自患有神经系统疾病的患者的成纤维细胞转化神经细胞过程中转分化效率低，分化不确定性高，缺乏精神类疾病模型等问题，本发明提供一种利用转分化技术诱导体细胞重编程至神经细胞模型的方法，具体为，通过神经细胞发育关键转录因子组合将精神分裂症患者的皮肤成纤维细胞直接转分化为神经细胞。

更为具体的，该方法构建神经诱导相关因子慢病毒质粒，用PCR的方法扩增ASCL1、MYT1L片段将其连接入慢病毒载体。并通过酶切、链接、大肠杆菌转化等得到重组质粒pLVX-ASCL1、pLVX-MYT1L，用侵染活力良好的病毒颗粒组合侵染体细胞，诱导形成神经样细胞。

在一种实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤：