[发明专利]一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法

说明书

本发明涉及一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法。本发明建立了更加高效便捷的乳腺癌患者肿瘤组织类器官(PDO)培养、传代与维持等关键技术环节的改进体系，包括多方面简化PDO细胞系建立、传代的操作步骤和方法，优化培养基、消化液和洗涤液成分等，最终成功建立乳腺癌PDO培养体系，相比于现有技术，成功率和传代次数基本一致，然而操作更简单，所需时间更短，为PDO模型将来拥有更好的临床和科研应用打好了基础，节省了相应成本。本发明还建立了乳腺癌PDO与肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的稳定的共培养体系，实现了PDO与CAFs可以同时培养、扩增并传代，且二者互不产生明显影响。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法。

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer，BC)是导致女性恶性肿瘤死亡的主要原因，全球范围内中国占新诊断病例12.2％，占BC死亡9.6％。根据国内最新流行病统计研究，乳腺癌发病率在女性恶性肿瘤中高居第一位，同时死亡率高居女性恶性肿瘤的第五位。乳腺癌是一个具有高度异质性的细胞群体，且可以分为多种亚型。现如今，对乳腺癌的研究主要依赖于已建立的细胞系，但是在维持肿瘤原发灶的细胞生物学和行为学特征方面，细胞系难以维持。而在临床治疗中，乳腺癌的异质性在指导使用药物中起着非常重要的作用，细胞系完全发挥不到此类临床应用价值。人源肿瘤异体移植模型(patient-derived xenograft，PDX)加以高通量测序或多色免疫组织化学等分析技术进行分子分析，对于解决乳腺肿瘤的复杂生物学非常有价值。但是，PDX模型成功率低，成本高，动物饲养周期长等缺点对该应用限制较大。近年来，病人来源类器官(patient-derived organoids，PDO)的3D培养在研究乳腺癌肿瘤方面提供了一个更加有效和可靠的模型。类器官培养可以保持原代肿瘤组织的异质性，并且在逐渐演化为新的分子分类的依据模型，此外，还可以用于验证药物敏感性、鉴定原代细胞的基因及染色体突变信息、构建异种移植动物模型等等。但是乳腺癌类器官的培养还存在培养的成功率不高，传代效率低，冻存复苏复活成功率低，培养基和培养体系尚需优化以及培养基价格昂贵难得等问题。

文献(Sachs,N.,de Ligt,J.,Kopper,O.,Gogola,E.,Bounova,G.,Weeber,F.etal.(2018)A living biobank of breast cancer organoids capturesdiseaseheterogeneity.Cell 172,373–86.)公开了一种可以长期培养和维持乳腺上皮类器官的方法，成功建立了100例以上乳腺癌原发瘤或者转移瘤类器官，乳腺癌类器官培养成功率在80％以上，并且对模型进行了深入的组织病理学、基因表达、基因测序等分析，同时还对乳腺癌类器官的药敏活性进行了深入研究。其公开分离的乳腺癌细胞重悬于BME滴剂中，加入优化的BC类器官培养基培养，关键在于添加了神经调节蛋白1(NRG-1)，其添加保证了可有效形成BC类器官和扩增长达20代。

然而，以上培养方法的培养基价格昂贵，操作也较为繁琐。目前未见如本申请所述的更为简洁、廉价、高效的乳腺癌类器官培养模式，也未见乳腺癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAFs)的共培养体系模型。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种更为简洁、廉价、高效的乳腺癌类器官培养模式以及和CAFs的共培养模式。

第一方面，本发明提供了一种乳腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：

A)取乳腺癌组织块，剪碎，加入消化液消化，向消化好的组织混合液加入洗涤液，洗涤后过滤得到细胞悬液，离心收集细胞，再加入洗涤液洗涤和离心收集细胞；

B)如观察到细胞离心团块中有明显可见的红细胞，则进行裂解红细胞处理；如观察到细胞离心团块中无明显可见的红细胞，则直接进行下一步；