[发明专利]一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法

权利要求书

1.一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计

根据痘病毒重组疫苗设计原理，选择羊痘病毒TK基因为外源基因插入的非必需区，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R双向启动子为备选启动子，绿色荧光蛋白为报告基因，与狂犬病毒G蛋白构建重组病毒的表达载体；为了筛选最优 选的疫苗组合，共设计了10种组合，G蛋白选用了全长和膜外区两种形式；

步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增

(1)引物设计

根据不同组合的具体设计需要，设计不同引物用于扩增目的基因片段，引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：27所示；

(2)PCR扩增

G蛋白与GFP融合表达的形式采用三片段融合PCR法将两蛋白基因与VV7.5启动子融合在一起，先分别扩增单个基因片段，再将3个片段融合扩增在一起，TK基因直接普通PCR扩增；

VV7.5与G蛋白或GFP蛋白表达的情况以及A8R双向启动子与G蛋白和GFP蛋白的连接，先分别扩增单个基因片段，采用两片段融合，再用酶切连接的方式构建；

步骤3、各种组合重组转移载体的构建

(1)TK基因：将扩增的TK基因直接与克隆载体PGEM-T载体连接得PGEM13-TK载体，并鉴定；

(2)酶切：PGEM13-TK载体，各融合PCR产物均进行Acc65 I的酶切；50μL酶切体系为：载体和PCR产物分别为35μL和30μL，Buffer各5μL，Acc65 I各3μL，ddH₂O分别为7μL和12μL，混匀后于37℃水浴酶切3-4h，并对酶切产物进行切胶回收纯化；对载体的酶切产物进行去磷酸化：去磷酸化酶2μL，10×Buffer 5μL，酶切载体20μL，ddH₂O 23μL；37℃1h，45℃15min；纯化回收，-20℃保存；

(3)连接

处理好的PCR产物及载体运用T4 DNA连接酶进行连接；10μL体系：PGM-TK13载体1μL，目的片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶Buffer 1μL，ddH₂O 2μL，并设立空白对照；

(4)转化

将各连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂板培养；

(5)转移载体构建的鉴定

挑取单菌落振摇培养6-8h，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定；

提取质粒做酶切鉴定；

最终成功构建狂犬病毒G蛋白-山羊痘病毒重组病毒转移载体8种：PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP，其序列如SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：35所示；

步骤4、狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒的重组及病毒纯化

(1)细胞制备：制备羊睾丸原代细胞；

(2)羊痘病毒疫苗株的培养：待羊睾丸原代细胞长好，接种山羊痘病毒疫苗株AV41，并观察生长情况；

(3)病毒重组：将构建并测序正确的重组转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GPP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP用Lipofectamin^TM2000脂质体转染试剂转染至已经感染了山羊痘病毒疫苗株的羊睾丸原代细胞，培养并观察细胞病变情况及绿色荧光情况；具体步骤如下：

待12孔板中羊睾丸原代细胞长至85-90％，吸弃细胞培养液，每孔接种10μL的羊痘病毒疫苗株病毒液和细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养12h；每孔准备2个无菌离心管，加入250μL DMEM，一管中加入转染试剂Lipofectamine^TM 2000 1.5μL，用移液器混匀，静置5min，另一管中加入转移载体质粒；将转染试剂混匀液加入质粒中，混匀之后静置18～20min；将混匀液加入细胞板孔中，6～8h后换细胞维持液，于细胞培养 箱中培养，并于12h、24h、36h、48h分别观察绿色荧光出现情况，出现荧光细胞即为重组病毒细胞；同时作不接种病毒直接转染质粒的对照；

(4)重组病毒的纯化

确认有带荧光的重组病毒后，吸弃培养液，加入已融化的无菌低熔点琼脂糖，并置于4℃的冰箱中5～10min，待固定液凝固后取出，在荧光显微镜下挑取荧光斑点于50μL DMEM纯培养液中备用；将挑取的荧光斑点收集液反复冻融三次后，对其进行10倍比稀释至10⁶-10⁷，然后分别接种羊睾丸原代细胞培养，再挑取荧光斑点稀释，如此传代4-6次，得到纯化的重组病毒；

(5)重组病毒纯化的鉴定

镜检：荧光显微镜观察有几乎99％的细胞均带荧光，说明重组病毒已经纯化，最终得到重组纯化的重组病毒两株：rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5；

PCR检测：取重组病毒的细胞培养物，提取其基因组，PCR检测其中G蛋白基因、GFP基因及TK基因，同时与山羊痘病毒疫苗株的细胞培养物做比较；

步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测

(1)G蛋白Western-blot检测

细胞培养纯化的重组病毒，细胞裂解液200μL裂解其培养物并用细胞铲刮取裂解产物，加SDS-PAGE上样Buffer并于沸水浴煮沸10min；做SDS-PAGE电泳，并按常规方法做考染或western blot检测；

(2)ELISA法检测细胞培养物中G蛋白表达情况

培养标准山羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，细胞全部被感染后，收取培养上清液并刮取底层细胞，细胞加细胞裂解液裂解并超声破碎，将其离心分为细胞上清和细胞沉淀；购买狂犬病毒G蛋白抗原检测ELISA试剂盒，常规方法检测以上处理样品中G蛋白含量；两株重组病毒G蛋白表达量与对照组山羊痘疫苗株显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的表达量明显高于全长；另外对细胞培养液、细胞破碎后上清及沉淀中G蛋白含量的检测结果是细胞培养液和细胞破碎后上清中G蛋白含量接近，且明高于细胞破碎后沉淀中，说明G蛋白表达后主要以分泌型蛋白形式表达在细胞外，非常适合做免疫抗原，是制备疫苗的最佳抗原蛋白；

步骤6、狂犬病毒G蛋白-山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测

(1)重组羊痘疫苗株注射液的制备

取标准羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5各取50μL接入至含5mL羔羊睾丸原代细胞的小25mL的细胞瓶中；5天细胞全部感染后反复冻融三次，12000rpm 10min离心取上清液，于-80℃保存；

(2)免疫接种试验

将12只健康状态一致的成年绵羊分为三组并标记，标准疫苗株：A、B、C、D；G蛋白全长重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5：I、II、III、IV；G蛋白膜外区重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5：1、2、3、4，采集羊免疫前血清待检；按分组在羊尾根部皮内注射0.5mL重组羊痘疫苗株注射液；观察羊只健康状况，并分别于0、5、12、19d采集羊全血分离血清待检；

(3)血清中G蛋白中和抗体检测

购买绵羊源G抗体检测试剂盒，按说明书进行操作检测羊血清中G蛋白中和抗体水平情况，与山羊痘病毒疫苗株的免疫血清为对照；两株重组病毒免疫组羊血清中G蛋白中和抗体与对照组显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的中和抗体浓度明显高于全长。