[发明专利]一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法

说明书

本发明公开了一种狂犬病毒G蛋白‑羊痘病毒重组疫苗的构建方法，包括以下步骤：步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计；步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增；步骤3、各种组合重组转移载体的构建；步骤4、狂犬病毒G蛋白‑羊痘病毒的重组及病毒纯化；步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测；步骤6、狂犬病毒G蛋白‑山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测。本发明的方法构建的疫苗可有效预防羊狂犬病，并且具有生产高效、简便、实用的特点，适合推广应用。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的高度致死性和接触性人兽共患病，几乎所有哺乳动物均可感染。我国是狂犬病高发国家之一，加之疆土富远辽阔，狼、狐狸等野生动物携带狂犬病毒的可能性较大，因此牧区牛羊受野生动物攻击而感染狂犬病的情况时有发生；加之宠物业兴起，宠物犬咬伤羊只而发病者亦有报道。如山西、内蒙、新疆等地均有牛羊被犬咬伤感染狂犬病的案例。羊痘病毒是痘病毒科的成员，是大型的线形DNA病毒，其基因组可容纳大量外源基因而不影响病毒的正常生长繁殖，因此其往往被作为载体构建生产活载体疫苗。

虽然目前狂犬疫苗可以有效的预防狂犬病的发生，但是注射狂犬疫苗成本高，周期长，程序复杂，很难在羊群中推广使用。为有效预防羊狂犬病，生产高效、简便、实用的疫苗非常必要，狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗可能是最好选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗及其构建方法，该方法以山羊痘病毒疫苗株为病毒活载体，以其腺甘酸酶基因(TK)为复制非必需区，以VV7.5基因或GTPV-A8R基因为启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，利用基因工程技术设计了10种能够重组狂犬病毒保护性抗原(G蛋白：GQ为G蛋白全长，GW为G蛋白膜外区)的表达载体；制备培养了羔羊睾丸原代细胞，用LipofectamineTM 2000转染试剂通过脂质体转染法将构建成功的8株重组转移载体分别转入预先感染羊痘病毒疫苗株的羔羊睾丸细胞中，经同源重组成功并将其培养获得能够表达狂犬病毒G蛋白的重组羊痘病毒，然后运用低熔点琼脂糖固定、挑荧光斑点和倍比稀释传代的方式进行纯化，一般纯化4-6代即可获得较纯的重组病毒毒株，并通过细胞GFP基因表达率、细胞病变及PCR方法确定重组病毒是否纯化。并通过Western-blot和ELISA方法初步评价G蛋白在重组病毒中的表达效果。免疫羊只后，用ELISA方法检测其血清中和抗体产生情况。

其具体技术方案为：

一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计

根据痘病毒重组疫苗设计原理，选择羊痘病毒TK基因为外源基因插入的非必需区，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R双向启动子为备选启动子，绿色荧光光蛋白为报告基因，与狂犬病毒G蛋白构建重组病毒的表达载体。为了筛选最选的疫苗组合，共设计了10种组合，G蛋白选用了全长和膜外区两种形式。

(1)TK基因中插入位点选Acc65 I；

(2)以VV7.5启动子融合表达GFP和G蛋白：分为GFP在N端，G蛋白在C端和G蛋白在N端，GFP在C端两种情况。G蛋白又有全长和膜外区两种情况，总计设计4种整合表达的情况；

(3)以VV7.5分别为GFP和G蛋白的启动子分别表达各自的蛋白，分表达方向相背和表达方向同向两种情况。考虑G蛋白有全长和膜外区之分，共设计4种单独表达的组合；

(4)以山羊痘病毒双向启动子A8R两侧分别表达G蛋白和GFP蛋白构建G蛋白全长和膜外区两种情况。

步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增

(1)引物设计