[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶突变体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体是由野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列突变而来，所述野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位的赖氨酸突变为苏氨酸或第122位的丙氨酸定点突变为甘氨酸；

所述野生型亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种根据权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，包括：

1)将野生型亮氨酸脱氢酶DNA与表达载体连接获得重组载体；

2)以步骤1)获得的重组载体为模板，通过PCR突变得到PCR产物；

当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位点时，所述PCR突变用引物为K89T-IR和K89T-IF，所述K89T-IR的序列如SEQ ID NO.2所示；所述K89T-IF的序列如SEQ IDNO.3所示；

当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第122位点时，所述PCR突变用引物为A122G-IF和A122G-IR，所述A122G-IF的序列如SEQ ID NO.4所示；所述A122G-IR的序列如SEQ ID NO.5所示；

3)用DPN1酶将步骤2)获得的PCR产物消化处理，得到突变重组载体；

4)将步骤3)获得的突变重组载体转入表达菌株，获得重组菌株，对所述重组菌株进行培养，得到亮氨酸脱氢酶突变体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述表达载体为pET28a质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤2)中，当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位点时，所述PCR突变程序为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸3min，35循环；72℃延伸10min；4℃保存。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤2)中，当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第122位点时，所述PCR突变程序为：4℃预变性4min；94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸3min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述消化处理的温度为36～38℃，时间为1.5～2.5h。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤4)所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤4)所述培养后还包括以下步骤：将所述培养得到的重组菌株破碎，收集上清液，经镍柱纯化后获得亮氨酸脱氢酶突变体。

9.权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体在改变亮氨酸脱氢酶底物谱中的应用。