[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶突变体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所述突变体是由野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列突变而来，所述野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位的赖氨酸饱和突变为NNN或第122位的丙氨酸定点突变为甘氨酸，所述野生型亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验结果表明：K89T亮氨酸脱氢酶对Asn和Thr表现出一定活性，A122G亮氨酸脱氢酶对Phe、His、Met表现一定活性，而野生型亮氨酸脱氢酶对这些氨基酸完全无活性；并且，K89T亮氨酸脱氢酶对于Asp氧化脱氨反应的酶活是野生型亮氨酸脱氢酶的2倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其构建方法和应用。

背景技术

亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LeuDH)属于短链脱氢酶家族，催化天然的底物4-甲基-2-氧代戊酸还原氨化得到L-亮氨酸，能可逆催化L-型氨基酸氧化脱氨合成α-酮酸，目前亮氨酸脱氢酶已经广泛应用于工业生产手性氨基酸。亮氨酸脱氢酶在自然界生物体内广泛存在，NCBI数据库检索其来源，总来源有11万种，动物来源有1757种，细菌来源有108864种，真菌来源有2221种，其余来源共计5000种。目前亮氨酸脱氢酶已经广泛应用于手性氨基酸催化合成。

亮氨酸脱氢酶应用十分广泛，主要集中于生物酶催化合成医药中间体方面。据文献报道，非蛋白源氨基酸在药物合成中有非常重要的作用，因此亮氨酸脱氢酶在合成非蛋白源氨基酸有巨大潜力和经济价值。例如常用于非蛋白源氨基酸L-叔亮氨酸及其衍生物合成，由于其侧链叔丁基团的空间位阻及强疏水性，常用于分子结构的调控，在多肽类药物中常替代其他氨基酸，赋予多肽分子更强的疏水性和稳定性。应用亮氨酸脱氢酶生物酶催化合成L-叔亮氨酸已经实现产业化。此外，亮氨酸脱氢酶在酶诊断方面具有重要应用。亮氨酸脱氢酶不仅作为酶制剂可用于患枫糖尿症病患血液中L-亮氨酸含量的诊断，也可与脲酶进行偶联测定尿素，这种方法具有较强的抗内源性氨干扰的能力。另外，亮氨酸脱氢酶也可用于血液中肿瘤及血管生长的标志物LAP(leucine aminopeptidase)含量的诊断，对于早期及时发现和治疗病毒性肝病具有重大作用。

虽然亮氨酸脱氢酶的应用范围非常广，然而由于其自身底物谱范围的限制，导致亮氨酸脱氢酶只能够催化合成L-亮氨酸等少数几个手性氨基酸，不能催化合成其他手性氨基酸。所以需要开拓新的方法来拓宽亮氨酸脱氢酶在工业生产和医药等行业的应用范围。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种亮氨酸脱氢酶突变体及其构建方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体是由野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列突变而来，所述野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位的赖氨酸饱和突变为NNN或第122位的丙氨酸定点突变为甘氨酸。

优选的，所述野生型亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种根据上述亮氨酸脱氢酶突变体的构建方法，包括：

1)将野生型亮氨酸脱氢酶DNA与表达载体连接获得重组载体；

2)以步骤1)获得的重组载体为模板，通过PCR突变得到PCR产物；

当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第89位点时，所述PCR突变用引物为K89饱-IR和K89饱-IF，所述K89饱-IR的序列如SEQ ID NO.2所示；所述K89饱-IF的序列如SEQ ID NO.3所示；

当突变位点为野生型亮氨酸脱氢酶氨基酸序列第122位点时，所述PCR突变用引物为A122G-IF和A122G-IR，所述A122G-IF的序列如SEQ ID NO.4所示；所述A122G-IR的序列如SEQ ID NO.5所示；