[发明专利]一种复合溶剂加水刺激法提取微藻胞内代谢组产物的方法

说明书

本发明提供了一种以微藻为对象，使用复合溶剂加水刺激工艺对其进行细胞膜溶解及代谢组产物提取的方法。第一步，以湿藻泥为原料，通过氯仿、甲醇混合溶剂初步破坏藻细胞膜并进行代谢物提取。第二步，向提取后的藻细胞加入去离子水，促进细胞膜解体。第三步，再次使用混合溶剂氯仿、甲醇提取胞内代谢物，并将两次提取得到的氯仿、甲醇溶液合并，加入氯化钠溶液离心分层。其中，六磷酸果糖、六磷酸葡萄糖等磷酸糖，丙酮酸、苹果酸等有机酸，ATP、ADP等能量物质，NA（D）P等还原力物质进入甲醇相。细胞色素、脂肪酸等进入氯仿相。该方法代谢物溶出率高，可以同时提取多种代谢物，并且大大降低了细胞干燥过程所引起的代谢物氧化变性问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，提供了一种代谢组产物提取方法。

背景技术

代谢组学研究已经成为现代生物技术中研究细胞代谢的重要手段。它是继基因组学、蛋白组学之后发展起来的能够准确反映胞内代谢水平的生物技术。

代谢组学利用高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，动态跟踪细胞、有机体分泌出来的体液中的代谢物的整体组成，借助多变量统计方法，来辩识和解析被研究对象的生理、病理状态及其与环境因子、基因组成等的关系。

微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取。生物样品采集后首先进行生物反应灭活、提取，然后运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢轮廓或代谢指纹。在样品淬灭和代谢物的提取过程中，应遵循的原则是：（1）淬灭工艺应立即冻结细胞代谢，使得代谢组能准确反映细胞此刻的代谢水平；（2）在淬灭过程中要求细胞膜无明显损伤，以免胞内代谢物外泄；（3）提取过程中应该尽可能多的提取胞内代谢物；（4）代谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰；（5）得到的样品基质应与所选择的分析方法相容。

微藻代谢产物的高效高质量提取一直是代谢组学准确测定的关键。由于微生物代谢产物众多，而且包括众多脂质物质，各组分溶解性质差异较大。因此，通常需要利用不同的溶剂分别提取，对样品量要求较多，且提取工作量大，对科研工作产生较大阻碍。

此外，由于微藻细胞中含有大量油脂，提取油脂类代谢产物时需要对微藻进行干燥，利用某些溶剂能溶解油脂的特性，通过渗透作用进入细胞，将细胞中的油脂提取出来。但是微藻细胞含水量超过80%，干燥过程耗时耗能，且利用溶剂的渗透作用很难高效彻底的提取脂质。

细胞破碎可以实现细胞内容物的释放，能够有效促进代谢物的提取，目前运用较多的微藻细胞破碎方法可分为机械法和非机械法。机械法包括超声法、高速高压均质法、反复冻融法等物理方法，这些方法虽然破碎效率高但是能耗也相对较高，且破碎过程耗时长，对于容易氧化变性的代谢物质来说不可取；非机械法包括碱热法、酸热法、酶解法等化学和生物方法，但这些方法则容易产生杂质，破坏代谢物提取的质量。

因此减少对微藻采样量的需求，通过单一溶剂或溶剂组合同时对微藻细胞内多种代谢物组分全面、高效、高纯度的提取，并使样品基质与所选择的分析方法相容是微藻代谢组学提取环节的一个关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合溶剂加水刺激法，有效溶解微藻细胞膜，并从湿的藻细胞中同时提取覆盖细胞各类主要代谢产物的方法，以克服以上说明中存在的技术缺陷。