[发明专利]一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用有效

专利信息
申请号: 202010805264.X 申请日: 2020-08-12
公开(公告)号: CN112409493B 公开(公告)日: 2022-09-30
发明(设计)人: 应向贤;王灿;张连春;陈梁;赵嫚;白彦兵;汪钊 申请(专利权)人: 浙江工业大学;杭州鑫富科技有限公司
主分类号: C07K19/00 分类号: C07K19/00;C12N9/04;C12N9/08;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
代理公司: 杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人: 黄美娟;李世玉
地址: 310014 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 重组 融合 及其 乙醛酸 合成 中的 应用
【权利要求书】:

1.一种重组融合酶,其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶GO、过氧化氢酶CAT和血红蛋白VsHGB通过连接肽连接构成;所述连接肽包括连接肽GSG或连接肽GGGGS;

所述融合酶为下列之一:VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT、VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT、CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB、CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB;

所述乙醇酸氧化酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示,编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示;所述过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,编码基因核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示;血红蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示,编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.一种重组融合酶,其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶突变体GOmut、过氧化氢酶和血红蛋白通过连接肽连接构成;所述乙醇酸氧化酶突变体GOmut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第267位蛋氨酸突变为苏氨酸,第362位丝氨酸突变为甘氨酸;重组融合酶为VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT。

3.一种权利要求1或2所述重组融合酶在乙醛酸甲酯合成中的应用,其特征在于所述应用为:将含融合酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎、离心分离所得的上清液即为粗酶液,以粗酶液作为生物催化剂,加入底物乙醇酸甲酯,以pH 6.0~10.0、50mM缓冲液为反应介质构成转化体系,在5~40℃、纯氧速率在0~3 L/h条件下进行反应,反应完毕后,反应液先经乙酸乙酯萃取,萃取液再通过减压蒸馏去除乙酸乙酯获得乙醛酸甲酯。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述转化体系中,底物加入终浓度为50~400mM,粗酶液加入量以总蛋白含量计终浓度为1-5 g/L。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含融合酶编码基因的工程菌接种至含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养12 h,获得种子液,将种子液以体积浓度2%的接种量接种至新鲜的含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至OD600为0.5~0.7,再加入终浓度为0.2 mM的IPTG,25℃诱导12 h,获得诱导培养液,再将诱导培养液于4℃和10000 rpm下离心10 min,弃去上清液,收集湿菌体;所述LB培养基组成为:5 g/L酵母粉,10 g/L氯化钠,10 g/L蛋白胨,pH 7.0~7.5。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述上清液按如下方法制备:将湿菌体以1 g:20 mL的比例溶解到50 mM、pH 8.0的Tris-HCl中,然后再使用超声破碎仪破碎细胞,以工作2 s,间隔6 s,功率125 W的程序破碎15 min,在4℃和8000 rpm下离心10 min,收集上清液,即为粗酶液。

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