[发明专利]一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用

权利要求书

1.一种重组融合酶，其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶GO、过氧化氢酶CAT和血红蛋白VsHGB通过连接肽连接构成；所述连接肽包括连接肽GSG或连接肽GGGGS；

所述融合酶为下列之一：VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT、VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT、CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB、CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB；

所述乙醇酸氧化酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码基因核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；血红蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.一种重组融合酶，其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶突变体GO^mut、过氧化氢酶和血红蛋白通过连接肽连接构成；所述乙醇酸氧化酶突变体GO^mut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第267位蛋氨酸突变为苏氨酸，第362位丝氨酸突变为甘氨酸；重组融合酶为VsHGB-GSG-GO^mut-GGGGS-CAT。

3.一种权利要求1或2所述重组融合酶在乙醛酸甲酯合成中的应用，其特征在于所述应用为：将含融合酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎、离心分离所得的上清液即为粗酶液，以粗酶液作为生物催化剂，加入底物乙醇酸甲酯，以pH 6.0~10.0、50mM缓冲液为反应介质构成转化体系，在5~40℃、纯氧速率在0~3 L/h条件下进行反应，反应完毕后，反应液先经乙酸乙酯萃取，萃取液再通过减压蒸馏去除乙酸乙酯获得乙醛酸甲酯。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物加入终浓度为50~400mM，粗酶液加入量以总蛋白含量计终浓度为1-5 g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含融合酶编码基因的工程菌接种至含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12 h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.5~0.7，再加入终浓度为0.2 mM的IPTG，25℃诱导12 h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000 rpm下离心10 min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成为：5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠，10 g/L蛋白胨，pH 7.0~7.5。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述上清液按如下方法制备：将湿菌体以1 g：20 mL的比例溶解到50 mM、pH 8.0的Tris-HCl中，然后再使用超声破碎仪破碎细胞，以工作2 s，间隔6 s，功率125 W的程序破碎15 min，在4℃和8000 rpm下离心10 min，收集上清液，即为粗酶液。