[发明专利]一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用

说明书

本发明公开了一种重组融合酶及其在合成乙醛酸甲酯中的应用，所述重组融合酶是将乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白通过连接肽连接构成。本发明以乙醇酸氧化酶突变体、过氧化氢酶和血红蛋白的融合酶为生物催化剂，催化200mM乙醇酸甲酯的氧化，反应6h后产物乙醛酸甲酯的得率达95.4％，所述方法绿色高效，条件温和，副产物少；除了氧气，不需加入其它辅底物和辅酶，适合大规模工业生产。

(一)技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白的融合酶及其在酶法合成乙醛酸甲酯中的应用。

(二)背景技术

乙醛酸甲酯是一种广泛应用于医药、化工等领域的重要中间体。作为医药中间体，乙醛酸甲酯可用于合成雷迪帕韦，雷迪帕韦可应用在治疗基因Ⅰ型的丙型肝炎感染疾病。作为化工原料，乙醛酸甲酯与异丁醛在酸性条件下以L-组氨酸作为有机催化剂发生醛醛缩合反应，再经醇脱氢酶还原，自发水解环化成D-泛解酸内酯。乙醛酸甲酯还可应用在生产铝合金门窗防晒涂料，该涂料防晒性能好，可以有效的保护铝合金门窗。乙醛酸甲酯的合成方法包括化学法和生物酶法，其中马来酸二甲酯臭氧氧化法、酒石酸二甲酯高碘酸氧化法、二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法、以及丙烯酸酯过氧化氢氧化法是制备乙醛酸甲酯的常用化学方法。化学法工艺条件要求苛刻，能耗大，反应过程中需要用到强氧化剂以及强酸，污染环境且会产生大量副产物，为后续的分离纯化也带来了极大的困难。相对应地，生物催化由于其高活力、高选择性和环境友好等特点而受到了越来越多的关注。生物酶法制备乙醛酸甲酯中，作为生物催化剂的酶可以是乙醇酸氧化酶，也可以是乙醇酸脱氢酶。乙醇酸氧化酶在氧气的参与下催化乙醇酸甲酯氧化产生乙醛酸甲酯和过氧化氢；过氧化氢对酶活力有害，因而往往需要过氧化氢酶经过氧化氢进一步分解成水和氧气。乙醇酸脱氢酶在烟酰胺辅酶的作用下催化乙醇酸甲酯脱氢生成乙醛酸甲酯，该方法一般需要添加昂贵的烟酰胺辅酶以及实现高效的辅酶再生。乙醇酸氧化酶和乙醇酸脱氢酶在合成乙醛酸甲酯中的应用各有优缺点。相比较而言，乙醇酸氧化酶不需要涉及烟酰胺辅酶的添加以及辅酶再生，更具有应用潜力。目前，乙醇酸氧化酶的催化活力以及稳定性尚达不到工业化生产要求的水平，运用基因工程、蛋白质工程、反应工程等手段提高其在酶法合成乙醛酸甲酯中的催化表现，可助推酶法酶法合成乙醛酸甲酯的产业化实施。

我们选取了来自菠菜的乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，对其基因进行定向进化，利用Fe²⁺显色剂构建乙醇酸氧化酶突变体的高通量筛选体系，从而筛选获得高酶活的乙醇酸氧化酶突变体M267S/S362G，并对位点M267和S362进行点饱和突变获得最优组合突变体M267T/S362G。通过将乙醇酸氧化酶突变体与过氧化氢酶和血红蛋白进行融合表达获得融合酶，该融合酶中乙醇酸氧化酶突变体在氧气参与下催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯和过氧化氢，过氧化氢由过氧化氢酶清除，血红蛋白增加溶氧，从而提高了催化活力，提升了反应的时空得率。以融合酶为生物催化剂，构建并优化了酶法氧化乙醇酸甲酯合成乙醛酸甲酯的反应体系。目前，尚未有乙醇酸氧化酶突变体M267T/S362G的报道，也未见融合表达乙醇酸氧化酶突变体M267T/S362G、过氧化氢酶和血红蛋白并应用于酶法合成乙醛酸甲酯的报道。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用，本发明构建了乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白的重组融合酶，以及利用该融合酶催化合成乙醛酸甲酯，该方法具有高效、条件温和、绿色环保、高产率等优点，避免了化学法中常见的过度氧化、条件苛刻、催化剂不够环保等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组融合酶，所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶(GO)、过氧化氢酶(CAT)和血红蛋白(VsHGB)通过连接肽连接构成；所述连接肽包括连接肽GSG或连接肽GGGGS。