[发明专利]灌流培养CHO细胞制备抗CLDN18_2抗体的方法

说明书

本发明提供了灌流培养CHO细胞制备抗CLDN18.2抗体的方法，包括：细胞复苏、种子细胞扩增、WAVE种子灌流扩增和反应器生产四个步骤。本发明通过灌流技术实现种子高密度培养，自主开发了灌流的培养基组成和灌流的工艺条件。同时，采用灌流技术实现种子高密度培养，用于单克隆抗体CLD18.2的生产工艺可节约设备投入，并且蛋白产量高，缩短了生产周期。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种灌流培养CHO细胞制备抗体的方法。

背景技术

生物制药行业发展迅速，截止到目前已有上百种抗体药物处于研发阶段或已上市。大部分的单克隆抗体都是由哺乳动物细胞表达，其研发和生产均在生物反应器中进行，最常见的工作体积规模从几升到几千升不等。以2000L规模为例，传统的生产过程包括：种子复苏→摇瓶扩增(N-X)→N-2扩增→N-1扩增→N生产(2000L搅拌反应器)，扩增过程中需进行两级种子反应器的扩增，增加了车间的设计及设备成本，并带来了操作风险的隐患。

灌流培养法是近年来用于哺乳动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物如单克隆抗体、嵌合抗体及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种操作方式。灌流培养法是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断的灌注新的培养基。但由于哺乳动物细胞体外培养的复杂性，常会出现细胞维持时间短、密度及活动低的问题。

CLDN18.2被发现作为抗体的靶点来治疗胃癌和食道癌，同时它也是胰腺癌开发抗体药物的靶点。美国专利8,168,427披露了一种抗CLDN18.2抗体为IMAB362，针对CLDN18.2的抗体在生产过程中同样面临上述问题，因此，亟需提供一种进一步优化的，可以实现高细胞密度的灌流培养CHO细胞制备抗体的方法。部分文献中也将CLDN18.2写为CLDN18_2。

发明内容

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供一种可以实现高细胞密度的灌流培养CHO细胞制备抗CLDN18.2抗体的方法。

本发明的技术方案为：

灌流培养CHO细胞制备抗CLDN18.2抗体的方法，包括以下步骤：

(1)细胞复苏：

将CHO细胞解冻后转移到基础培养基1中，离心弃上清，再用基础培养基1将细胞重悬后，置于二氧化碳摇床中培养至活细胞密度达到(3～6)×10⁶cells/ml时转移至下一级培养；

(2)种子细胞扩增：

将步骤(1)得到的细胞接种到基础培养基1中进行培养，当活细胞密度达到(3～6)×10⁶cells/ml时转移至下一级培养；

(3)WAVE种子灌流扩增：

将步骤(2)得到的细胞接种到基础培养基2中，再置于WAVE反应器中培养，培养2～5天后换液，至最终活细胞密度为(80～120)×10⁶cells/ml；

(4)反应器生产：

将步骤(3)得到的细胞接入生物反应器中培养并收获；

所述CHO细胞能够表达抗CLDN18.2抗体。

优选地，步骤(1)中所述的离心条件为200～300g下离心3～8min。

优选地，步骤(1)中所述的基础培养基1为ActiPro。

优选地，步骤(1)中所述的二氧化碳摇床的培养条件为36.5±1℃，105～125rpm，5±0.2％CO₂，78～82％湿度。