[发明专利]一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法

权利要求书

1.一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法，其特征及步骤在于：所述的方法以农杆菌为介导载体，以离体保存的蛇足石杉叶状体为受体，通过预培养、农杆菌侵染、共培养、推迟筛选、筛选、叶状体增殖及阳性植株的鉴定步骤，获得具有可遗传目的基因的蛇足石杉阳性植株；

步骤1：预培养

将离体保存的蛇足石杉叶状体置于培养基中预培养，得到预培养外植体；预培养时间为2天，光照2000lx、13h/d，温度为24～26℃；

培养基为SH培养基的基础上，添加萘乙酸至终浓度0.5mg/L、蔗糖至终浓度20g/L和琼脂粉至终浓度6.5g/L；

步骤2：农杆菌侵染

将含有质粒载体的农杆菌单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.5，之后进行离心处理保留沉淀物，再向沉淀物中加入SH培养基并混匀，得到农杆菌侵染液；将预培养外植体于农杆菌浸染液中浸染20min，得到浸染后的外植体；

所述的农杆菌为EHA105菌株，内含pBI121表达载体，pBI121连接了GUS基因和抗潮霉素基因；

步骤3：共培养

将农杆菌侵染后的外植体蛇足石杉叶状体接种到共培养培养基上进行共培养4天，得到共培养外植体；共培养培养基成分和培养条件与步骤1相同；

步骤4：推迟筛选

将共培养外植体移入推迟筛选培养基进行推迟培养14d，得到推迟筛选外植体；

推迟筛选培养基中添加了250mg/L的头孢霉素，其余成分和培养条件与步骤1相同；

步骤5：筛选

将推迟筛选外植体转接到含有潮霉素和头孢霉素的筛选培养基中筛选培养30天；

筛选培养基中含有浓度为250mg/L的头孢霉素和浓度为4.6mg/L的潮霉素，筛选培养基其余成分和培养条件与步骤1相同；

步骤6：叶状体增殖

蛇足石杉叶状体进一步增殖培养至直径1～3cm；

步骤7：阳性植株的鉴定

具体包括目的基因的PCR扩增和GUS染色，验证再生植株是否为遗传转化植株；PCR反应程序为：94℃初始变性10min，然后进行33个循环，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，最后在72℃下延伸10min，10℃保温；利用GUS染色试剂盒进行GUS组织化学染色。