[发明专利]一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法

说明书

本发明公开了一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法，蛇足石杉叶状体遗传转化体系包括预培养、浸染、共培养、推迟筛选、筛选、叶状体增殖和阳性植株的鉴定步骤，通过农杆菌介导向蛇足石杉叶状体中转入pBI121表达载体，pBI121连接了GUS基因和抗潮霉素基因。本发明方法不仅包括得到转基因植株的步骤，还包括对转基因植株的验证，形成了完整的转基因体系，为蛇足石杉基因功能组学的研究和育种奠定基础，同时也对后续的基因工程研究奠定了重要基础，从而培育出高产石杉碱甲的蛇足石杉新资源。

技术领域

本发明一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法，具体属于药用植物基因工程领域和中医药技术领域。

背景技术

蛇足石杉Huperzia serrate(Thunb)Trev.，又名千层塔、蛇足石松、蛇足草等，为石杉科石杉属蕨类植物，全草具有解毒、止痛、散瘀消肿功效。自1972年中国首次报道，蛇足石杉中所含的生物碱--石杉碱甲(Huperzine A)在动物试验中有松弛横纹肌的作用后，大量实验结果表明Huperzine A是一种高效、低毒、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可用于改善记忆力、治疗重症肌无力和老年性痴呆等疾病，并对抑制有机磷酸中毒有一定功效。石杉碱甲的化学合成是化学合成研究的热点，但目前所报道的合成方法都具有一定的局限性，很难以低成本大量合成具有高效生物活性的石杉碱甲。从植物中提取石杉碱甲依旧是最有效的途径，但植物中石杉碱甲含量低、植物野生材料有限。

为了解决石杉碱甲资源短缺，市场供不应求这一问题，一方面我们要更加深入研究蛇足石杉人工繁殖技术，增加蛇足石杉种植规模；另一方面，要提高蛇足石杉中石杉碱甲含量，扩大石杉碱甲产量，双管齐下解决石杉碱甲药源问题。近些年来，涂艺声课题组吉枝单等人通过离体培养诱导，先后都获得了产石杉碱甲的蛇足石杉叶状体，并进一步研究了石杉碱甲积累与蛇足石杉离体培养物形态的相关性，以及底物诱导如何提高石杉碱甲含量等，取得了一些进展。然而，各种蛇足石杉离体培养物中的石杉碱甲含量仍相对较低，还很难根本上解决石杉碱甲的药源问题。因此，建立蛇足石杉遗传转化体系，深入研究石杉碱甲生物合成的途径，在分子及基因水平上调控石杉碱甲的合成，进而提高石杉碱甲的含量。

农杆菌介导法是常见的植物遗传转化方法之一，具有操作简单、耗费时间短、成本低廉且转化率高等优点。目前该方法已成功应用于多种植物的遗传转换体系，如瓜叶菊、马铃薯、高粱、黑果枸杞等，但关于蛇足石杉遗传转化的研究尚未有人涉及，本发明首次利用蛇足石杉叶状体为外植体，建立其遗传转化体系的方法，为下一步研究利用基因工程技术从从基因水平上解决石杉碱甲的药源难题奠定基础。

发明内容

为了在分子及基因水平上调控石杉碱甲的合成，进而提高石杉碱甲的含量，最终解决石杉碱甲资源短缺，市场供不应求这一问题。本发明提供一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法。

本发明一种建立农杆菌介导蛇足石杉叶状体遗传转化体系的方法以农杆菌为介导载体，以离体保存的蛇足石杉叶状体为受体，通过预培养、农杆菌侵染、共培养、推迟筛选、筛选、叶状体增殖及阳性植株的鉴定步骤，获得具有可遗传目的基因的蛇足石杉阳性植株；

步骤1：预培养

将离体保存的蛇足石杉叶状体置于培养基中预培养，得到预培养外植体；预培养时间为2天，光照2000lx、13h/d，温度为24～26℃；

培养基为SH培养基的基础上，添加萘乙酸至终浓度0.5mg/L、蔗糖至终浓度20g/L和琼脂粉至终浓度6.5g/L；

步骤2：农杆菌侵染

将含有质粒载体的农杆菌单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.5，之后进行离心处理保留沉淀物，再向沉淀物中加入SH培养基并混匀，得到农杆菌侵染液；将预培养外植体于农杆菌浸染液中浸染20min，得到浸染后的外植体；