[发明专利]一种产虫草素基因工程菌及其应用

说明书

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种产虫草素基因工程菌及其应用。本发明通过转化携带pyr4序列、Ura3序列、Amp抗性基因序列和AMA1序列的质粒pQF1到宿主A.nidulans A1145及LO8030中，经验证得到正确的含有AMA1质粒的转化子，并研究了携带AMA1的质粒对这两种常用宿主的影响。UPLC结果显示在CD‑ST液体培养基中，AMA1转化子的发酵粗提物中虫草素(COR)产量增加了1.72～1.84倍，虫草素的最高产量为277mg/L。这项研究表明携带AMA1的pQF1质粒可以在这两个构巢曲霉宿主中促进虫草素的产生。同时，本研究为虫草素的产量提高提供了潜在的工程策略。

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种产虫草素基因工程菌及其应用。

背景技术

虫草素(cordycepin,COR)是蛹虫草(Cordyceps militaris，或C.militaris)代谢产物中非常具有效益的一个核苷类化合物。研究发现COR具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等多种药理活性(Soltani M,Malek R A,Elmarzugi N A,et al.:Cordycepin:A Biotherapeutic Molecule from Medicinal Mushroom,Biology ofMacrofungi,2018:319-349)。1997年，美国已将虫草素用于三期临床实验，用于治疗急性pre-B和pre-T淋巴细胞白血病患者[康冀川康,文庭池,钱一鑫,雷帮星.虫草菌素药理学研究进展[J].菌物学报,2011,30(2):191-197]。如今，来源于C.militaris的高纯度COR的售价已达到$50-$80/kg。

与存在局限(如工艺复杂、合成过程使用大量有机试剂等)的化学法相比，生物发酵法更有利于COR的生产。采用生物发酵法主要是利用构巢曲霉(Aspergillus nidulans，或A.nidulans)或C.militaris发酵制备COR。尽管COR初始产率在A.nidulans最高产量达到249.46μg/mL，略高于C.militaris(228.45μg/mL)，可以作为COR新的生物来源[张红霞,吴畏,陈伟,et al.无冠构巢曲霉与北冬虫夏草发酵液中虫草素及腺苷含量比较分析研究[J].上海农业学报,2006,(02):34-37]。然而目前关于COR的工业生产仍是使用C.militaris进行发酵[Zhang Q,Liu Y.The Strategies for Increasing CordycepinProduction of Cordyceps Militaris by Liquid Fermentation[J].Fungal GenomicsBiology,2016,6(1)]，而以A.nidulans进行发酵制备COR尚未形成规模化工业生产。

发明内容

本发明的目标之一在于提供一种产虫草素的基因工程菌，其以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)为模式菌株构建而成，具有较高的COR产量。

本发明的目标之二在于提供上述产虫草素的基因工程菌在生产虫草素中的应用。

为此，本发明第一方面提供了一种产虫草素的基因工程菌，其为含有质粒pQF1的重组构巢曲霉菌。

根据本发明，所述质粒pQF1携带有pyr4序列、URA3序列、Amp抗性基因序列和AMA1序列的一种或几种。

本发明中，所述AMA1序列包括内源性AMA1序列，以及外源性AMA1序列。

在本发明的一些实施例中，所述外源性AMA1序列来源于构巢曲霉菌GO51株，所述构巢曲霉菌G051的保藏编号为ATCC 38163；优选地，所述AMA1序列如SEQ No.1所示。

在本发明的一些实施例中，所述pyr4序列来源于粗糙脉孢菌OR74A菌株；优选地，所述粗糙脉孢菌OR74A菌株的保藏编号为MYA-4619D-2；进一步优选地，所述pyr4序列如SEQNo.2所示。