[发明专利]四种血液来源蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了四种血液来源蛋白的制备方法，采用阴/阳离子交换层析和亲和层析相配合的纯化方法，从同一份血液样本中，同时纯化出α1‑抗胰蛋白酶(AAT)、转铁蛋白(TRF)、α1‑酸性糖蛋白(AAG)和结合珠蛋白(HP)四种蛋白，本发明公开的制备方法操作简单，所得到的目的蛋白活性稳定、纯度高、收率高，适合用于工业生产和临床应用。

技术领域

本发明涉及蛋白的分离纯化，具体涉及四种血液来源蛋白的纯化方法。

背景技术

在生物医药快速发展的时代，血液制品行业已成为生物医药及诊断产业的重要组成部分。目前血浆来源的血液制品(血浆蛋白药物)主要有白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、蛋白酶抑制剂四大类，发达国家的血液制品企业可以从血浆中获取超过20种的血浆蛋白药物。然而，受人才、技术、临床认知水平等因素制约，国内的血液制品企业最多只能获得不超过10种，且主要是基于低温乙醇沉淀工艺分离提纯的产品，包括人血白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子VIII产品等。目前国内主要提纯血浆蛋白药物仍基于Cohn等人二十世纪四十年代发明的低温乙醇法，通过调节乙醇浓度、盐浓度、温度和pH，依靠血浆蛋白的溶解度不同来分离，此方法虽然程序简单、溶剂价廉，适用于工业化生产，但有较大的局限性，主要可分离血浆中含量较高的蛋白(如白蛋白和免疫球蛋白)，对含量较少的蛋白(如α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白等)则很难提纯。

α1-抗胰蛋白酶(AAT)制剂可以用来治疗先天或后天性AAT缺乏所致肺气肿、急性肺损伤、囊性纤维化、成人呼吸紧迫综合症等疾病，在临床上具有较高的应用价值。

转铁蛋白(TRF)已有的许多研究证实转铁蛋白具有抗菌的功能，同时也是细胞生长和增殖所必须的生长因子。但是制备转铁蛋白的常规纯化方法(例如冷乙醇沉淀法，硫酸铵沉淀法，利凡诺沉淀法等)由于生产效率低、生产过程繁琐以及产品纯度不够高等原因已经不能满足现阶段对于转铁蛋白的需求。

结合珠蛋白(HP)结合珠蛋白是一种急性期时相反应蛋白。可以用来治疗溶血症疾病，给与HP之后，可以防止Hb尿的发生。此外HP可能在治疗Hb铁的细菌引起的危机生命的感染方面也具有一定价值。随着现代医疗的进步，HP的需求量日益增大。

α1-酸性糖蛋白(AAG)是主要的急性时相反应蛋白，在急性炎症时含量增高，与免疫防御功能有关。随着各种试剂盒的研发，AAG蛋白无论是作为研究的目的蛋白还是验证的标准品，其需求都在逐年增大，所以AAG蛋白的提纯和制备至关重要。

随着现代医疗的进步，ATT、TRF、HP、AAG的需求日益增大，但由于其性质各异，在血清中单个纯化，会存在纯度低，收率低，不利于放大等问题。现有技术很难做到多种蛋白同时纯化，因为用有机溶剂或高盐处理后的蛋白，往往活性偏低，严重影响后续使用。因此，需要寻找一种同时制备ATT、TRF、HP、AAG的方法。

发明内容

为了解决上述难以纯化多种蛋白的问题，本发明提供四种血液来源蛋白的纯化方法，利用同样的样本同时纯化四种蛋白，降低成本，获得四种高纯度、高收率的蛋白。

本发明纯化的四种蛋白为ATT、TRF、HP、AAG，配合离子交换层析和亲和层析，达到分离纯化四种蛋白的目的。

本发明方法操作简单，成本低，产物纯度高，稳定性强，且处理量大，适合大规模生产。

具体包括如下步骤：

a、将血清透析到pH为4.2到4.8的层析缓冲液中，得透析样品，用阴离子交换层析对所述样品进行纯化，收集流穿液I和洗脱液I；

b、洗脱液I经亲和层析纯化得流穿液II及HP蛋白；

c、流穿液II透析到pH为3.0-3.8的层析缓冲液中，得透析流穿液II，用阴离子交换层析对所述透析流穿液II进行纯化，收集AAG蛋白；