[发明专利]醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用

说明书

本发明提供了一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)‑苯基乙二醇中的应用，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，其基因序列如序列表中的序列2所示。醇脱氢酶基因mladh在催化合成(R)‑苯基乙二醇中的应用。将醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH构建双酶偶联催化体系，在所述体系中，醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的酶活性比例为1∶5~10。本发明构建了醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的双酶耦合系统，实现了辅酶NADH的原位再生。本发明以磷酸缓冲盐为水相的体系中引入大豆油作为有机相，降低了底物和产物对催化反应的抑制，促进了催化转化的效率，转化率达到99%，e.e.值在99%以上。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用。

背景技术

(R)-苯基乙二醇((R)-PED)是一种重要的手性模型化合物，可以用于合成β-内酰胺类抗生素、(R)-诺氟西汀、(R)-氟西汀、(R)-{N-1-[(3-甲巯基苯基)乙基]}-3-苯基-1-丙胺等等手性药物，用作治疗精神障碍、代谢紊乱和甲状旁腺功能亢进等疾病。另外，(R)-PED也可进一步制成(R)-扁桃酸，后者常被用于头孢菌素类抗生素羟苄四唑头孢菌素的侧链修饰剂。

(R)-PED的生产方法主要分为手性拆分法和不对称合成法。手性拆分法是指将外消旋体转化为单一对映体，拆分的方法较多，主要方法有：吸附拆分法，结晶拆分法，色谱分离拆分法，化学拆分法，萃取拆分法，动力学拆分法，膜技术拆分法。其中色谱分离拆分法采用手性色谱高效又快速地分析手性化合物，还可应用于对映体之间的纯度测定。但拆分法制备手性醇过程中，往往需要对羟基进行保护，难度大且易生成其他衍生物，生成光学纯的对映异构体的产率不会高于50％，因此，这种方法应用较少。不对称合成法是指将含有潜手性羰基化合物经过不对称加氢还原反应转化得到手性醇，主要分为化学合成法和生物催化法。其中，化学合成法是通过添加重金属手性催化剂来实现羰基化合物的还原。最初，日本的Noyori等人发现，手性Schiff碱与Cu²⁺络合后产物对于环丙烷有催化作用，对映选择性达到10％，自此后，越来越多的手性催化剂被人们挖掘利用。Letko等人以2-羟基苯乙酮(2-HAP)为反应原料，通过添加手性铱催化剂，得到了(R)-PED。但由于手性试剂的选择性低、成本高、三废排放等问题，因此手性试剂还原法不能称之为清洁生产工艺。相比之下，生物催化法具有显著优势，如：反应条件温和，环境友好；高立体选择性；反应速度快；反应集中成本较低等。因此，生物催化法已逐渐被国内外认可，成为合成手性醇的发展趋势，目前，也已经有许多成功的应用。Lee等人通过萘双氧化酶立体选择性氧化苯乙烯，成功制备出(R)-PED；Cui等用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不对称催化2-HAP得到(R)-PED；Zhang等人以具有专一生成R型产物的羰基还原酶重组大肠杆菌为生物催化剂，成功得到了(R)-PED。

但是，应用生物酶催化的方式进行工业化生产还未见报道。生物催化法的底物转化率和产物的光学纯度仍具有较大的提升空间，其中寻找合适的生物催化剂就是一项重要因素。因此，筛选具有高底物转化率和高产物光学纯度的优良转化酶类对生物酶催化反应的进一步放大具有重要的实用价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用，以解决现有化学合成法选择性低、成本高、三废排放以及现有生物催化法底物转化率和产物的光学纯度不理想的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种醇脱氢酶MLADH，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

编码上述醇脱氢酶MLADH的基因mladh，其基因序列如序列表中的序列2所示。

所述的基因mladh在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用。