[发明专利]一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法

权利要求书

1.一种基于多重PCR技术和DNB技术的STR分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.待测样品预处理，提取待测样品DNA；

S2.针对待测STR基因座设计多重PCR引物并建立关于DNB环化中STR序列交叉互连的评估体系，调整多重PCR引物扩增方向；

S3.以步骤S1待测样品DNA为模板，利用步骤S2设计的多重PCR引物进行第一轮PCR扩增反应；

S4.将第一轮PCR产物纯化，进行第二轮PCR扩增引入高通量Index；

S5.将第二轮PCR扩增回收、纯化；

S6.PCR产物进行DNB测序；

步骤S2所述评估体系为对任意两条长度分别为m、n的扩增产物序列，在每个可能的碱基配对状态上，逐一移位进行相互比对，计算互连得分，即匹配碱基数和不匹配碱基数的差值；产生(m*n)次碱基比对和(m+n-1)次互连得分，取其中的最高得分作为m、n两条序列的最终互连得分；对于一组包含p条不同序列的集合，自身和两两比较，产生1/2(p²+p)组比较结果；根据比较结果选择一套使得体系互连反应总得分最低的重复基序类型组合，并据此调整所有引物扩增方向，以保证扩增出的STR序列间不发生严重的交叉互连。

2.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述待测STR基因座包括D1S1656、D2S1338、D2S441、TPOX、D3S1358、FGA、CSF1PO、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、TH01、D12S391、vWA、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11或D22S1045中的至少两个。

3.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述多重PCR引物除了遵循传统多重PCR引物设计原则，还兼顾不同长度、类型和拷贝数STR位点扩增子间的均衡性，使得设计的PCR扩增引物能够精确涵盖用于STR长度计算的核心重复区，并且根据二代测序序列起始质量较高的特点，通过调整STR重复区的起始位置，以达到最优的测序质量。

4.根据权利要求2或3所述的STR分型方法，其特征在于，所述STR基因座多重PCR引物分别包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO:1～40所示。

5.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应的扩增体系为：JN-1500MIX 6μL，基因组DNA 20-300ng，3×EnzymeHT10μL，加H₂O至30μL。

6.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应的扩增程序为98℃3～5min；98℃20s，60℃6min，共20个循环；72℃6min。

7.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述高通量Index要求根据碱基平衡和激光平衡原则、GC含量30～70％、连续重复碱基小于等于5、本身反向互补不一致、汉明距离大于3、与目前主流平台Index不冲突的严格条件。

8.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，所述第二轮PCR扩增反应的扩增体系为：2×HIFI_Enzyme 15μL，Nuclease-Free H₂O 13μL，Primer_MGI-F 1μL，MGI_Bar_xxx1μL，共30μL。

9.根据权利要求1所述的STR分型方法，其特征在于，第二轮PCR扩增反应的扩增程序为：98℃2min；98℃15s，58℃15s，72℃30s，6个循环；72℃2min。

10.权利要求1～9任一项所述的方法在个体识别和/或亲权鉴定中的应用。