[发明专利]一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法

说明书

本发明公开了一种胰高血糖素样肽‑1类似物的纯化方法，所述方法包括使用聚合物反相填料纯化GLP‑1类似物。所述方法具有单位体积填料载量高的特点，能够减少样品损失，提高纯化产率，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及一种肽纯化方法，特别是一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。近年来中国糖尿病患病率增长迅速，已经成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，患病人数超过一亿。

胰高血糖素样肽1（GLP-1）通过葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。

胰高血糖素样肽1（GLP-1）在人体内具有生物活性的主要形式是GLP-1 (7-37)，但其易被二肽基肽酶IV（DPP-IV）水解，半衰期不到5分钟。因此成药的GLP-1受体激动剂必须延长半衰期。目前市场上代表性较为成熟的GLP1类药物为诺和诺德公司研制的利拉鲁肽（Liraglutide）和司美鲁肽（Semaglutide），其分子结构为GLP-1类似物分子上增加脂肪酸侧链后形成的衍生物。通过遮蔽（或突变）DPP-IV酶切位点和白蛋白结合增长体内存留时间的作用，分别实现了一天一次给药方式。

目前，诺和诺德采用酵母重组表达方式生产，国内仿制品多采用化学合成或大肠杆菌重组表达实现。化学合成法多采用小粒径（10μm以下）C8或C18硅胶反相色谱纯化；重组表达生产的GLP-1类似物，多采用阴离子（如CN110498849A，CN04592381A）阳离子（如CN110128552A，CN110724187A）交换层析进行捕获纯化。

小粒径硅胶C8/C18反相色谱，对样品要求较高，不适用于含有较多杂质的重组蛋白样品的捕获纯化；同时，该类填料多以乙腈等有害有机溶剂作为洗脱相，环保压力大。此外，由于此类色谱填料对碱耐受能力极差，不利于填料的在位清洗和重复使用。重组表达生产的GLP-1类似物，如采用阴离子交换层析进行捕获纯化，受宿主细胞DNA，内毒素等杂质影响较大；而阳离子交换捕获纯化的方法，需要将待捕获的样品的pH值调至蛋白等电点以下，在对于GLP-1类样品，由于宿主蛋白和核酸的存在，在跨越等电点的过程中经常发生GLP-1类样品的共沉淀，且难于复溶，造成样品大量损失。

发明内容

为了减少样品损失，提高纯化产率，本发明提供了一种纯化GLP-1类似物的方法，其使用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物作为反相填料，可实现接近或超过90%的产率，同时可使GLP-1类似物的载量达30g / L升色谱填料以上。

具体来说，本发明提出了如下技术方案：

一种式(I)所示的GLP-1类似物的纯化方法，所述方法包括使用聚合物反相填料纯化GLP-1类似物；优选地，所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，

X₇X₈X₉X₁₀TFTSDVSSYLEX₂₂QAAX₂₆X₂₇FIAWLVX₃₄GX₃₆G (I)

其中：

X₇为H或缺失；

X₈为A、Aib、G、S、V或缺失；

X₉为E或缺失；