[发明专利]一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法

权利要求书

1.一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法，其特征在于具体步骤为：

（1）试验液配置：称取目标污染物原药，溶于BG-II培养液中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；

（2）绿藻培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的蛋白核小球藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用BG-II培养液稀释至所需的初始藻细胞浓度，获得处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液；

（3）毒性暴露及藻细胞收集：采用摇瓶法，在无菌条件下，将步骤（2）获得的处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶20 mL藻液；再次向各锥形瓶中依次添加步骤（1）配制的梯度浓度的试验液至总体积为100 mL，并将BG-II培养液作为空白对照，使各个浓度组的每个目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8mg/L；加入目标污染物后，将蛋白核小球藻置于原培养条件下暴露处理，每天定时摇动3~4次，连续培养至96 h后，取5mL均匀藻液，冷冻离心后收集藻细胞，用PBS洗涤1~2次离心收集细胞沉淀物；

（4）装载荧光探针DCFH-DA及荧光检测：将DCFH-DA溶于培养基中混合均匀制得浓度为10μM的混合液，然后取1mL混合液加入到步骤（3）收集的细胞沉淀物中，37℃避光孵育细胞45min，将孵育后的藻细胞用培养基清洗2~3次，用PBS重悬，过滤后，采用流式细胞仪检测，通过DCF的荧光强度，反映不同浓度污染物暴露下对绿藻细胞内活性氧含量的影响，从而实现污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定；

所述步骤（1）中的目标污染物是克霉唑；

所述步骤（2）中的初始藻细胞浓度为4×10⁵个cell /mL；

所述步骤（3）中的原培养条件为：温度22 ℃，光照度2500~3000 lux，光暗周期12h:12h；

所述步骤（3）中冷冻离心的条件为：温度4℃，转速1500 g，时间5min；

所述步骤（4）中过滤采用的是70μmd的细胞滤网；

所属步骤（4）中流式细胞仪的型号为CytoFLEX 流式细胞分析仪。