[发明专利]一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法

说明书

本发明公开了一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。利用蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）评价典型污染物唑类杀菌剂（克霉唑）对绿藻细胞内活性氧含量的的影响。根据在唑类杀菌剂农药作用下对单一绿藻细胞的DCF荧光强度，评价污染物对绿藻细胞内活性氧产生的影响。该方法对绿藻细胞内活性氧含量的变化的检测结果更精确，克服了污染物在不同浓度暴露下导致细胞数量变化从而使荧光强度测量不准确的问题。DCF的荧光强度与细胞内活性氧含量成正比，能够更直观的反映污染物在某个浓度下对的细胞内的活性氧含量的影响。本方法测试简便快速，检测系统本底低，灵敏度高，重复性好。

技术领域

本发明属于环境毒理学领域，特别涉及一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。该方法利用流式细胞仪检测农药污染物唑类杀菌剂（克霉唑）对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）细胞内活性氧含量的影响。

背景技术

绿藻是水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作用，是反映水体环境质量的重要指标。活性氧（ROS）对生物体十分重要，但过量会对生物体产生氧化损伤导致细胞死亡。由于ROS寿命短、反应活性高，且大部分都存在于体内很难被捕获，因此活体中ROS的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。

DCFH-DA是迄今最常用、最灵敏的细胞内ROS检测探针，进入细胞后被酯酶水解为DCFH，在ROS存在时DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质DCF。流式细胞术采用细胞作为实验对象，悬液中的单细胞或其他生物粒子通过检测标记的DCF荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选。传统的方法是将细胞进行孵育后，使用酶标仪、色谱分析等技术记录细胞所发射的荧光强弱确定细胞内ROS的含量，常常会忽略细胞数量变化所导致的荧光强度的改变。由于污染物的影响可能会导致处理组和对照组之间活细胞数目的差异，因此有必要对活细胞数量进行定量以补偿细胞数量不同所造成的荧光强度的差异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定方法。使之可以更直观、全面地评价污染物对绿藻细胞内活性氧含量的的影响。

具体步骤为：

（1）试验液配置：称取目标污染物原药，溶于BG-II培养液中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液。

（2）绿藻培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的蛋白核小球藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用BG-II培养液稀释至所需的初始藻细胞浓度，获得处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液。

（3）毒性暴露及藻细胞收集：采用摇瓶法，在无菌条件下，将步骤（2）获得的处于对数生长期的蛋白核小球藻均匀藻液，分装于250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶20 mL藻液；再次向各锥形瓶中依次添加步骤（1）配制的梯度浓度的试验液至总体积为100 mL，并将BG-II培养液作为空白对照，使各个浓度组的每个目标污染物的浓度分别为0、0.008、0.08、0.8和8 mg/L；加入目标污染物后，将蛋白核小球藻置于原培养条件下暴露处理，每天定时摇动3~4次，连续培养至96 h后，取5mL均匀藻液，冷冻离心后收集藻细胞，用PBS洗涤1~2次离心收集细胞沉淀物。

（4）装载荧光探针DCFH-DA及荧光检测：将DCFH-DA溶于培养基中混合均匀制得浓度为10μM的混合液，然后取1mL混合液加入到步骤（3）收集的细胞沉淀物中，37℃避光孵育细胞45min，将孵育后的藻细胞用培养基清洗2~3次，用PBS重悬，过滤后，采用流式细胞仪检测，通过DCF的荧光强度，反映不同浓度污染物暴露下对绿藻细胞内活性氧含量的影响，从而实现污染物对绿藻细胞内活性氧含量影响的测定。

所述步骤（1）中的目标污染物是克霉唑。