[发明专利]利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺

权利要求书

1.利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1.培养基的配制和灭菌

配制好的液体培养基中，各物质的重量百分含量是：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH₂PO₄0.05％,MgSO₄·7H₂O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量是12.5％，余量为蒸馏水，将制备好的液体培养基在121℃下进行高压灭菌20min；

步骤2.菌粉活化和扩大培养

用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板上，经分离纯化后挑取单个菌落接种于50mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d，然后将50mL液体无菌操作整体接种于400mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d；

步骤3.发酵罐发酵培养：

发酵罐装样量80％，确保发酵罐完全密封后，将整个发酵罐置于灭菌锅内于121℃下进行高压灭菌20min，待灭菌结束冷却至室温后将其从灭菌锅中取出连接上发酵罐配套的控制系统；调整通气量为1vvm，初始搅拌转速为100rpm,维持pH为6.0-6.5，温度29℃-30℃；

将步骤2中400mL种子菌液以火焰接种法通过接菌口接种于发酵罐的培养基中进行发酵培养，将搅拌转速与溶氧值联合，按照溶氧值降至10％以下时将转速提高1倍调整搅拌转速，每隔12h取样1次，每次取样时取2份，2份的平均值作为最终结果，各取20-25mL，通过干重法测得发酵液中生物量，通过DNS法测定发酵液中葡萄糖含量，当发酵液中葡萄糖含量低于5g/L时，开始补料，补料液为一定浓度的麦麸汁、无水葡萄糖和蛋白胨的混合液体，中途补料成分为600mL麦麸汁中加入120g无水葡萄糖和96g蛋白胨，体积维持在500-700mL，无水葡萄糖和蛋白胨的比例维持在5:2至5:4，补料液混匀后在121℃下进行高压灭菌20min，冷却至室温后于超净工作台中倒入发酵罐的补料瓶中，通过蠕动泵泵入发酵罐中，补料速度维持在0.25-0.75mL/min，待补料结束，发酵液中葡萄糖含量降低至3g/L及以下时，结束发酵；

步骤4.收集菌丝

发酵结束后发酵液用500目滤布过滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用500目滤布过滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分，收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分；

步骤5.菌丝制品

将干燥处理后的菌丝体用小型打粉机粉碎2min制成菌粉，取一小部分菌粉用来检测其中蛋白质、多糖含量以及麦角甾醇、总三萜活性物质的含量，其余菌粉用真空密封袋抽真空制成产品。

2.根据权利要求1所述的利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，步骤1中麦麸汁是按照每升蒸馏水中加入160g麦麸煮30min，过滤、离心后取上清液所得。

3.根据权利要求1所述的利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，步骤2中，固体培养基格外添加2％的琼脂。