[发明专利]乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用

权利要求书

1.乳铁蛋白的核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。

3.乳铁蛋白适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述适配体与载体进行共价偶联得到的。

4.根据权利要求3所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH₂)₇-或C6间接臂-(CH₂)₆-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。

5.权利要求4所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)载体的洗涤：取300μL N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖置于离心管中，用1mM盐酸洗涤1-2次，每次1-2mL；

2)适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体溶解于500μL MES缓冲液中，于92-96℃复性5-10min，然后室温放置30-60min；

3)偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于20-30℃摇床震荡反应0.5h；

4)封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于20-30℃摇床震摇反应1h，得到载体-适配体填料；

5)洗涤：将上述载体-适配体填料用清洗缓冲液洗涤，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；

6)装柱：取容积1mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-1.5cm，加入结合缓冲液0.5-3mL，于4℃保存；

其中，所述MES缓冲液：0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；

所述封闭缓冲液：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；

所述清洗缓冲液：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH 7.2；

所述结合缓冲液：137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄·12H₂O,2mM NaH₂PO₄,1mMMgCl₂,2mM CaCl₂,pH 7.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质为聚丙烯、聚苯乙烯。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，下筛板的孔径为10μm。

8.权利要求3或4所述亲和柱或按照权利要求5-7任一项所述方法制备的亲和柱在富集和/或纯化样品中乳铁蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品选自化妆品、食品、动物饲料、医药。