[发明专利]乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。该亲和柱以N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，将能够高亲和力、高特异性识别乳铁蛋白的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后特异性亲和填料装填固相萃取柱。该亲和柱主要应用于样品中乳铁蛋白特异性识别和富集纯化，纯化后仍能保持乳铁蛋白的天然活性，该方法快速、简便、准确，亲和柱可重复使用，既可用于大型仪器检测前的样品前处理，也可用于乳铁蛋白的分离纯化，在化妆品、食品、动物生产、医疗等领域中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说，涉及一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种相对分子量约为80KDa的非血红素铁结合性蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁当中，特别是初乳中乳铁蛋白含量较高。乳铁蛋白具有多种生物学功能，它不仅可以调节人体铁质转移，促进骨骼生长，而且具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫等功能。目前，其已被认为是安全的食品添加剂，广泛应用在乳制品及相关的婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、保健食品和医药等领域。但迄今为止还没有关于乳铁蛋白的国家检测标准。常用的乳铁蛋白检测技术主要有：酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、分光光度法、高效液相色谱法等。其中，高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，灵敏度高等优点，是目前食品检测领域应用最广泛的方法之一。因高效液相色谱对样品纯度要求较高，且乳制品及相关样品的基质成分相当复杂，故无法直接进行液相色谱检测，目前常用肝素亲和柱来分离纯化目标物，但肝素亲和柱价格昂贵，增加了检测成本。

核酸适配体是一小段体外筛选得到的寡核苷酸片段，能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)进行多次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究尚处于起步阶段，但已经表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。

基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的。适配体亲和柱纯化结合常规高效液相色谱检测目标物将成为重要的发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。

本发明的构思如下：将高特异性、高亲和力的乳铁蛋白的核酸适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到乳铁蛋白的特异性偶联胶。偶联胶装柱后组装成高亲和力的乳铁蛋白适配体亲和柱。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种乳铁蛋白的核酸适配体，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。

第三方面，本发明提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将SEQ ID NO:1的适配体与载体进行共价偶联得到的。

优选地，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH₂)₇-或C6间接臂-(CH₂)₆-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。